Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Quantitativ-bildanalytische Untersuchungen zur Gewebeeosinophilie bei atopischer Dermatitis und allergischem Kontaktekzem

Plickert, Julia Karolin

It was the aim of this study to give a quantitative and qualitative description of tissue eosinophilia both in atopic dermatitis (n = 33) and spontaneous and provoked (patch testing) lesions of allergic contact dermatitis (n = 52). The recently published method of morphometric computer-aided data analysis (KIEHL et al. 1999, KIEHL et al. 2001) was used, containing a quantitative assessment of eosinophilic granule protein deposition by image analysis of immunostaining (QUIAI). Using the antibodies EG1, EG2, MBP and neutrophil elastase (NE), the frequency, amount and distribution of eosinophil-associated granule proteins was evaluated, including the extracellular protein deposition as an indicator of complete activation and degranulation of eosinophils. In addition, an eosinophil count in standard H&E sections was performed. Finally, tissue eosinophilia was correlated to relevant clinical, laboratory and histopathological parameters.   Results: Eosinophils and their specific granule proteins were found to be involved both in skin lesions of IgE-mediated allergic reactions (atopic dermatitis) and in T-cell mediated delayed type hypersensitivity reactions (allergic contact dermatitis). Patients with atopic dermatitis showed significant higher depositions of EG1 and EG2 than of MBP or neutrophil elastase. In biopsies of provoked contact dermatitis, the amount of EG1 was significantly higher than EG2, and more MBP was detected than in AD. In spontaneous allergic contact dermatitis, the focal maximum of eosinophilic infiltration was significantly higher regarding EG1 than EG2. In biopsies of spontaneous contact dermatitis, slightly lower amounts of total eosinophilic protein (EGP) were detected comparing to AD, whereas in provoked lesions total EGP deposition was increased. Summarizing spontaneous and provoked lesions and comparing to AD, no significant differences concerning total tissue eosinophilia (EGP) were detected (p > 0,05). Both allergic contact dermatitis and atopic dermatitis demonstrated a superficial tissue distribution of eosinophilia including a most frequently detected focal maximum of eosinophilic infiltration in a depth up to 0,93 mm from the epidermis. In biopsies of 72h-patch-testing, tissue eosinophilia was located more superficially with most frequently detected focal maximums of immunoreactivity in a depth up to 0,46 mm from epidermis. For effective use of external therapeutics (phototherapy, ointments etc.) against eosinophils and their proteins, these findings should be considered. Both eczematous dermatoses showed an involvement of eosinophils in biopsies of acute dermatitis (characterized by epidermal spongiosis) as well as in biopsies of chronic disease (characterized by epidermal hyperplasia), significant differences regarding the extent of tissue eosinophilia were not found. Furthermore, patients of AD, suffering from acute exacerbation of chronic disease, showed significant higher levels of tissue eosinophilia than patients with chronic disease. In contrast to previous statements by other authors, this study was able to demonstrate, that tissue eosinophilia is a regular event for both acute and chronic lesions of atopic dermatitis and allergic contact dermatitis. In AD the routinely used diagnostic features ‘SCORAD’ and ‘total serum-IgE’ did not show any correlation to tissue eosinophilia. However, in biopsies of atopic persons showing great numbers and values of allergen-specific IgE-antibodies in bloodsamples by FEIA-analysis, marked tissue deposition of MBP was detectable. In contact dermatitis, patients with numerous sensitizations to contact allergens (type IV-allergy) showed significant higher amounts of tissue eosinophilia than patients with a single positive patch test reaction. Patients with contact dermatitis and an additional positive atopic diathese (FEIA-analysis of bloodsamples: total IgE ³ 100 kU/l, detection of allergen-specific IgE-antibodies against common saisonal aeroallergens) demonstrated pronounced tissue eosinophilia. In addition, in contact dermatitis total serum-IgE-level correlated significantly to tissue eosinophilia. Moreover, concerning both dermatoses, blood eosinophilia (concentration of ECP respectively numbers of intact eosinophils) could not be considered to be representative for eosinophil involvement in ekzematous skin.   In summary, this study was able to provide evidence, that amounts of intact eosinophils in H&E stained standard sections did not often correlate with relevant clinical, laboratory and histopathological parameters, and consequently, the number of intact eosinophils was shown not to be representative for the total extent of tissue eosinophilia. In contrast, the method of QUIAI allowed the evaluation of the complete involvement of eosinophils in cutaneous inflammatory process in atopic dermatitis and allergic contact dermatitis because of simultaneous detection of both cell-dependent and functional important extracellular deposition of eosinophilic granule proteins. Using the method of QUIAI, this study was able to demonstrate that tissue eosinophilia is not only a regular event in atopic dermatitis but also in allergic contact dermatitis and that eosinophils were found to be involved in acute and chronic lesions of both dermatoses.  

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Gewebeeosinophilie in läsionaler Haut bei atopischer Dermatitis (n = 33) sowie beim spontanen bzw. im Epikutantest provozierten allergischen Kontaktekzem (n = 52) sowohl quantitativ als auch qualitativ zu erfassen und zu vergleichen. Hierzu wurde die von KIEHL et al. (1999; 2001) etablierte Methodik einer computergestützten Bildanalyse an immunhistochemisch gefärbten Präparaten (QUIAI, quantitative automated image analysis of immunostaining) angewandt, bei der sowohl zelluläre als auch extrazelluläre Ablagerungen eosinophilen-assoziierter Proteine erfasst werden. Die Färbung erfolgte unter Einsatz der eosinophilen-spezifischen Antikörper EG1 (gegen ECP), EG2 (gegen ECP und EDN/EPX), MBP (gegen MBP) und Neutrophilenelastase (NE) als Marker für die Gewebeneutrophilie. Zusätzlich wurde die Anzahl intakter eosinophiler Granulozyten als Eosinophilendichte (n/mm2) bzw. als fokales Maximum eosinophiler Infiltration am H&E gefärbten Präparat bestimmt. Das Ausmaß der zellgebunden bzw. mittels QUIAI zellunabhängig ermittelten Gewebeeosinophilie wurde schließlich mit einer Reihe relevanter klinischer, laborchemischer und histopathologischer Parameter korreliert.   Die Ergebnisse sahen wie folgt aus: Ablagerungen eosinophiler Granulaproteine waren sowohl in IgE-vermittelten allergischen Reaktionen vom Soforttyp (atopische Dermatitis) als auch in T-Zell-mediierten Reaktionen vom verzögerten Typ (allergisches Kontaktekzem) infolge von Eosinophilen-Rekrutierung und -aktivierung in läsionaler Haut anzutreffen. Bei atopischer Dermatitis wurden mittels EG1 und EG2 signifikant stärkere Ablagerungen eosinophilen-assoziierter Proteine im Gewebe nachgewiesen als mit MBP bzw. im Vergleich zur Deposition neutrophiler Elastase. In den Gruppen provozierter Kontaktallergien (Epikutantest 72h und 96h) zeigten sich jeweils signifikante Mehrablagerungen von EG1 im Vergleich zu EG2. Verglichen mit der AD konnte hier zudem signifikant mehr MBP im Gewebe detektiert werden. Beim spontanen Kontaktekzem erwies sich die fokale Maximaldeposition von EG1 als signifikant stärker als die von EG2. In Biopsien spontaner Läsionen eines allergischen Kontaktekzems war eine leicht geringere Gesamt-Gewebeeosinophilie als bei der atopischen Dermatitis zu verzeichnen (Kontaktekzem spontan: Mean-IAF %: 0,14 ± 0,18 / Max-IAF %: 2,02 ± 1,84; AD: Mean-IAF %: 0,17 ± 0,31 / Max-IAF %: 2,72 ± 3,35), während die im Epikutantest provozierten Ekzeme eine stärkere Gesamtdeposition eosinophiler Granulaproteine aufwiesen (Epi 72: Mean-IAF %: 0,58 ± 1,01 / Max-IAF %: 3,64 ± 3,87; Epi 96: Mean-IAF: 0,31 ± 0,44 / Max-IAF: 2,68 ± 3,01). Fasst man alle Untergruppen der Kontaktallergie zusammen ergaben sich jedoch im Vergleich zur AD keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Gesamt-Gewebeeosinophilie (p > 0,05). Sowohl bei der atopischen Dermatitis als auch bei der Kontaktallergie konnten die fokalen Maxima eosinophiler Infiltration am häufigsten in einer Tiefe bis zu 0,93 mm ab Epidermis nachgewiesen werden. Effektiv eingesetzte externe Therapeutika (Phototherapie, Salben, etc.) hinsichtlich eosinophiler Granulozyten und ihrer Ablagerungsprodukte müssen demnach eine solche Mindesteindringtiefe gewährleisten. Biopsien aus läsionaler Haut von 72h-Epikutantestungen wiesen ein oberflächlicheres Ablagerungsmuster eosinophiler Proteine mit einer häufigsten Detektionstiefe bis zu 0,46 mm ab Epidermis auf. Beide Erkrankungen zeigten eine Beteiligung Eosinophiler sowohl in Biopsien akuter Läsionen (gekennzeichnet durch epidermale Spongiose) als auch in Biopsien chronischer Ekzeme (gekennzeichnet durch Epidermishyperplasie), wobei signifikante Unterschiede im Ausmaß der Gewebeeosinophilie nicht nachgewiesen werden konnten. Bei AD-Patienten mit akuter Exazerbation eines chronischen Geschehens wurden jedoch signifikant stärkere Ablagerungen eosinophiler Granulaproteine deutlich als bei solchen mit chronischen Ekzemen. Im Gegensatz zu früheren Hypothesen sprechen die eigenen Ergebnisse somit für eine pathogenetische Relevanz eosinophiler Granulozyten sowohl bei der akuten als auch bei der chronischen Form von atopischer Dermatitis und allergischem Kontaktekzem. Die Ergebnisse der in der Diagnostik der AD routinemäßig durchgeführten Untersuchungen ‚SCORAD’ und ‚Serum-Gesamt-IgE’ zeigten keine signifikanten Korrelationen zum Ausmaß der ermittelten Gewebeeosinophilie und konnten demnach nicht als repräsentativ für die tatsächliche Beteiligung eosinophiler Granulozyten in läsionaler Haut angesehen werden. Für das Patientenkollektiv mit atopischer Dermatitis konnte jedoch belegt werden, dass eine große Anzahl bzw. hohe Werte mittels FEIA-Analyse nachgewiesener spezifischer Sensibilisierungen vom Soforttyp gegenüber häufigen saisonalen und perennialen Aeroallergen mit verstärktem Nachweis des eosinophilen Granulaproteins MBP im Gewebe einher ging. Patienten mit im Epikutantest ermittelten multiplen Sensibilisierungen gegenüber Kontaktallergenen zeigten eine signifikant stärkere Gewebeeosinophilie als Patienten mit nur einem einzelnen positiven Testergebnis. Außerdem ließ sich im Patientenkollektiv mit einem allergischen Kontaktekzem bei zusätzlicher atopischer Diathese (Gesamt-IgE-Spiegel über 100 kU/l bzw. Nachweis spezifischer Sensibilisierungen vom Soforttyp gegenüber häufigen saisonalen und perennialen Aeroallergenen) eine signifikant stärkere Gewebeeosinophilie nachweisen als in der Vergleichsgruppe mit alleiniger Typ IV-Reaktion. Zudem ließen Patienten mit einem allergischen Kontaktekzem signifikant positive Korrelationen zwischen dem gemessenen Serum-Gesamt-IgE-Level und dem Ausmaß der Gewebeeosinophilie erkennen. Für beide Untersuchungsgruppen zeigte sich zudem, dass die Eosinophilenparameter des peripheren Blutes (ECP-Konzentration bzw. Anzahl intakter Eosinophiler) keine sicheren Rückschlüsse auf die Beteiligung Eosinophiler im kutanen Entzündungsgeschehen erlaubten.   Insgesamt konnte in der Studie belegt werden, dass die anhand von H&E gefärbten Präparaten ermittelte Anzahl intakter eosinophiler Granulozyten im Gewebe selten mit den erhobenen klinischen, laborchemischen oder histopathologischen Parametern korrelierte und somit keinen repräsentativen Wert für das Ausmaß der tatsächlichen Gewebeeosinophilie bot. Demgegenüber gestattete die QUIAI-Methodik unter Berücksichtigung sowohl zellgebundener als auch extrazellulärer und damit funktionell entscheidender Granuladepositionen eine vollständige Erfassung der Beteiligung eosinophiler Granulozyten am kutanen Entzündungsprozeß bei atopischer Dermatitis und allergischem Kontaktekzem. So konnte in dieser Studie mittels QUIAI-Methode gezeigt werden, dass eine deutliche Gewebeeosinophilie ein reguläres Ereignis in Biopsien von atopischer Dermatitis und von allergischen Kontaktekzemen darstellt und sowohl in akuten als auch in chronischen Läsionen beider Dermatosen anzutreffen ist.  

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Plickert, Julia Karolin: Quantitativ-bildanalytische Untersuchungen zur Gewebeeosinophilie bei atopischer Dermatitis und allergischem Kontaktekzem. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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