Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der Wirkung von Hypoxie auf das glutamaterge System als Tiermodell für die Ätiopathogenese der Schizophrenie

Starke, Manfred

In schizophrenia, pregnancy and birth complications occur at an increased rate in the case history of the patients. Especially the occurrence of hypoxia-associated complications points to a possible role of hypoxia or ischemia in the pathophysiology of the disease. The influence of hypoxia and ischemia on the glutamatergic receptors was investigated in an animal model study as a glutamatergic deficit is assumed in schizophrenia. By means of behavior tests, indicating deviations with schizophrenia, further associations of hypoxia and ischemia with the subsequent occurrence of disturbance of behavior will be demonstrated with rats to develop and characterize an improved model of the relation between molecularbiology and behavior.  96 rats were exposed to chronic hypoxia or combined hypoxia/ischemia in order to examine them subsequently for molecular-biological changes or behavioral deviations. The animals were divided into 4 groups. Group 1 was ventilated, from the 4th to the 8th postnatal day of life, 6hrs/d, in an airtight cage with 11% O2 / 89% N2 (chronic hypoxia = CH); group 2 serving as control group. The corresponding cage was of identical design, but ventilated with air. The animals of group 3 had, on the 8th postnatal day, under anesthesia, 2x at an interval of 10 min, for 8 min each time, their arteria carotis communis clamped off on both sides (combined hypoxia/ischemia = HI). During this clamp-off phase, the animals were placed in a gas-tight container with 8% O2 / 92%N2, group 4 serving as control group. The animals were likewise operated on under anesthesia, but the carotid arteries were not clamped off. On the 11th postnatal day, 10 animals out of each group were killed, their brains exposed and quick-frozen in isopentane and liquid nitrogen. From the following planes of the brains, in a cryostat, thin slices were cut (16µm for the “receptor autoradiography” = RAR, 20µm for the “in situ hybridization” = ISH) and fixed on object slides: pre-frontal cortex (PC), striatum (ST) and hippocampus (HIP). Within these planes, the following regions were examined: PC: Fr1/2, Cg1/3 and IL; ST: CPu and AcbC; HIP: CA1, CA2, CA3a, CA3c and DG. One half of the preparations was examined by means of receptor autoradiography. In the process, three different receptors were marked radioactively with the following ligands: the NMDA receptor with [3H]-MK801, the AMPA-receptor with [3H]-AMPA and the GABAA-receptor with [3H]-muscimol. The ligand MK801 was mixed to spermidine or glycine during the main incubation for binding enhanced. The other half of the preparations was examined by means of in situ hybridization; in the process, the mRNAs of the following NMDA receptor subunits were labeled by 35S: NR1, NR2A, NR2B, NR2C and NR2D. Next, the labeled preparations were placed onto radiation-sensitive film sheets and incubated for 5 weeks in the case of NMDA and GABAA, 4 weeks in the case of AMPA and 5 days in the case of ISH. The film sheets were developed, the images on them photographed and digitally stored. Finally, the described regions of the rat brains were examined for their binding with the aid of an evaluation program. The surviving animals were examined, on the 85th postnatal day (± 4d), for their prepulse inhibition (PPI) with prepulses (20ms) at 60, 70 and 80 dB, an inter-stimulus interval (50ms) and pulses at 100 dB (20ms). A reduced number of NMDA, AMPA and GABAA receptors was noted after chronical hypoxia and combined hypoxia/ischemia in the examined areas. Moreover, an increased expression of the mRNA of the NR1 subunit in CA2 region of hippocampus was noted. An increased expression of the mRNAs of the NR1 subunits after chronical hypoxia was noted (PC: Cg1/3, Fr1/2, IL; HIP: CA1, CA2, DG) as well as an increase of the NR2B subunits (AcbC), the NR2C subunits (HIP: CA3a) and the NR2D subunits(AcbC). A reduction of the mRNA of the NR2A subunit (HIP: CA3a, CA3c) can be registered in other regions. Following combined hypoxia/ischemia an increase of the NR1 subunits in the prefrontal cortex (Fr1/2) and the hippocampus (DG) was found. Also, an increase of the NR2B subunits in hippocampus (CA2, CA3a) and an increase of the NR2D subunits in the prefrontal cortex (Cg1/3, IL) was observed. A decrease of the mRNA of the NR2A subunits in the hippocampus (CA3a, CA3c) following chronical hypoxia was found. Following combined hypoxia/ischemia the NR2D subunits in the nucleus accumbens and the NR2C subunits of the CA3a region of the hippocampus were decreased. The effects by chronical hypoxia seem to be larger than the effects by combined hypoxia/ischemia. When measuring the PPI in 56 experimental animals on the 85th day of life (± 4d), a significant reduction of the PPI in both experimental groups was noted. The reduction of receptor numbers in the case of NMDA, AMPA and GABAA receptors is an indication of the damage and impact of chronic hypoxia or combined hypoxia/ischemia. Upregulation of the NR1 and NR2B subunits could be interpreted as a compensatory attempt. In the process, the reduction of the NMDA receptor number suggests a hypofunction of this receptor, which is also assumed in the pathophysiology of schizophrenia. The increase of the easily excitable NR2B subunit could be seen as a shift of conditions in favor of more readily responding units. The non-uniform development of the NR2C subunit could reflect both the diverse quality and effect of chronic hypoxia and combined hypoxia/ischemia and the diverse sensitivities of the brain regions. Increase of the NR2D subunits can be interpreted as a further indication that chronic hypoxia or combined hypoxia/ischemia could be involved in the etiopathogenesis of schizophrenia. This study indicates a connection between chronic hypoxia or combined hypoxia/ischemia and morphologic and quantitative changes at the NMDA, AMPA- and GABAA receptors. It seems logical to consider the measured PPI deficits as a result of these changes. In summary, the findings demonstrate a critical role of hypoxia and ischemia in a vulnerable phase of brain development and indicate a possible involvement in the pathophysiology of schizophrenia. The results of these tests demonstrate that hypoxia and/or ischemia are able to cause significant damage to NMDA-, AMPA- and GABAA-receptors that can not be repaired until adulthood. These results suggest that chronic hypoxia respective combined hypoxia/ischemia are the cause for the acute molecularbiological changes in the young rat brain as well as for the later disruption in the sensorimotor gating in adult rats. These results are in accordance to other investigations. Therefore, this animal model seems to be a useful tool to investigate the connection of disorders in behaviour and molecularbiological changes of receptors. It seems also to be helpful to establish new strategies for the treatment of schizophrenia and the prevention of the effects of oxygene lack during pregnancy and during birth.  

Bei der Schizophrenie kommen Schwangerschafts- und Geburtskomplikationen gehäuft in der Vorgeschichte der Patienten vor. Besonders das Auftreten hypoxie-assoziierter Komplikationen weist auf eine mögliche Rolle von Hypoxie oder Ischämie in der Pathophysiologie der Erkrankung hin. In dieser Arbeit wurde der Einfluß von Hypoxie und Ischämie auf glutamaterge Rezeptoren am Tiermodell untersucht, da bei der Schizophrenie ein glutamaterges Defizit angenommen wird. Anhand von Messungen der Reaktionsinhibition durch Schreckreize mit vorhergehenden Präpulsen, einem Verhalten, das bei schizophrenen Patienten verändert ist, soll durch das Anführen von Zusammenhängen zwischen Hypoxie und Ischämie mit dem späteren Auftreten von Verhaltensänderungen an Ratten ein verbessertes Modell für die Beziehung von Molekularbiologie zu Verhalten erstellt und getestet werden. 96 Ratten wurden Hypoxie bzw. Ischämie ausgesetzt, um sie anschließend auf molekularbiologische Veränderungen bzw. Verhaltensabweichungen zu untersuchen. Die Tiere wurden in 4 Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1 wurde vom 4. bis zum 8. postnatalen Lebenstag 6h/d in einem luftdichten Käfig mit 11% O2 / 89% N2 (Chronische Hypoxie = CH) behandelt. Gruppe 2 diente als Kontrollgruppe hierzu. Der entsprechende Käfig war identisch aufgebaut, aber es wurde Luft eingeleitet. Den Tieren der Gruppe 3 wurde am 8. postnatalen Tag in Narkose 2 mal im Abstand von 10 min für je 8 min beidseitig die Arteria carotis communis abgeklemmt (kombinierte Hypoxie/Ischämie = HI). Während dieser Abklemmphase wurden die Tiere in ein gasdichtes Behältnis mit 8% O2 / 92% N2 gelegt. Gruppe 4 diente als Kontrollgruppe hierzu. Die Tiere wurden ebenso in Narkose operiert, aber die Carotiden wurden nicht abgeklemmt. Am 11. postnatalen Tag wurden je Gruppe 10 Tiere getötet, die Gehirne freipräpariert und in Isopentan und flüssigem Stickstoff schockgefroren. Aus folgenden Ebenen der Gehirne wurden in einem Kryostaten dünne Schnitte hergestellt (16µm für die Rezeptorautoradiographie = RAR, 20µm für die In-Situ-Hybridisierung = ISH) und auf Objektträgern fixiert: Präfrontaler Cortex (PC), Striatum (ST) und Hippocampus (HIP). Innerhalb dieser Ebenen wurden folgende Regionen untersucht: PC: Fr1/2, Cg1/3 und IL; ST: CPu und AcbC; HIP: CA1, CA2, CA3a, CA3c und DG.  Die eine Hälfte der Präparate wurde mittels Rezeptorautoradiographie (RAR) untersucht. Drei verschiedene Rezeptoren wurden dabei mit folgenden Liganden radioaktiv markiert: der NMDA-Rezeptor mit [3H]-MK801, der AMPA-Rezeptor mit [3H]-AMPA und der GABA-A-Rezeptor mit [3H]-Muscimol. Dem Liganden MK801 wurde zur Verstärkung der Bindung Spermidin bzw. Glycin während der Hauptinkubation zugemischt. Die andere Hälfte der Präparate wurde mittels In-Situ-Hybridisierung untersucht, wobei mit Hilfe von mit 35S markierten Sonden die mRNAs folgender NMDA-Rezeptor-Untereinheiten markiert werden: NR1, NR2A, NR2B, NR2C und NR2D. Anschließend wurden die markierten Präparate auf strahlungssensitive Folien gelegt und bei NMDA und GABA 5 Wochen,  bei AMPA 4 Wochen und bei der ISH 5 Tage inkubiert. Die Folien wurden entwickelt, die Abbildungen darauf abfotografiert und digital gespeichert. Schließlich konnten mit einem Auswertungsprogramm die beschriebenen Regionen der Rattengehirne auf ihre stattgefundene Bindung untersucht werden. Die überlebenden Tiere wurden am 85. postnatalen Tag (± 4d) in einem Verhaltensversuch auf ihre Schreckreaktionshemmung (PPI) mit Präpulsen (20ms) bei 60, 70 und 80 dB, einem Inter-Stimulus Intervall (50ms) und Schreckreizen (100 dB, 20ms) untersucht. Es war eine verminderte Rezeptoranzahl bezüglich NMDA-, AMPA- und GABAA-Rezeptoren in den untersuchten Ebenen sowohl nach chronischer Hypoxie als auch nach kombinierter Hypoxie/Ischämie festzustellen. Ein Anstieg an NMDA-Rezeptoren war nach chronischer Hypoxie in der CA2 Region des Hippocampus festzustellen. Es kann desweiteren eine vermehrte Expression der mRNA der NR1-Untereinheiten nach chronischer Hypoxie (PC: Cg1/3, Fr1/2, IL; HIP: CA1, CA2, DG), der NR2B-Untereinheit (Nucleus Accumbens = AcbC), der NR2C-Untereinheiten (HIP: CA3a) und der NR2D-Untereinheiten (AcbC) festgestellt werden. Eine Verminderung ist feststellbar bei den NR2A-Untereinheiten im Hippocampus (CA3A; CA3c). Nach kombinierter Hypoxie/Ischämie ist eine Heraufregulation der NR1-Untereinheiten im Präfrontalen Cortex (Fr1/2) und im Hippocampus (DG) feststellbar; eine Heraufregulation zeigt sich bei den NR2B-Untereinheiten im Hippocampus (CA2; CA3a) und bei den NR2D-Untereinheiten im Präfrontalen Cortex (Cg1/3; IL). Eine Verminderung der mRNA der NR2A-Untereinheiten ist im Hippocampus (CA3a, CA3c) nach chronischer Hypoxie festzustellen; nach kombinierter Hypoxie/Ischämie sind die NR2D-Untereinheiten im Nucleus Accumbens und die NR2C-Untereinheiten CA3a-Region des Hippocampus erniedrigt. Die Effekte durch chronische Hypoxie schienen größer zu sein als die Effekte durch kombinierte Hypoxie/Ischämie. Bei der Messung der PPI bei 56 Versuchstieren am 85. Lebenstag (± 4d) hat sich eine deutliche Erniedrigung der Hemmung der Schreckreaktion in beiden Versuchsgruppen gezeigt. Das Absinken der Rezeptorzahlen bei NMDA-, AMPA- und GABAA-Rezeptoren ist ein Hinweis auf die erfolgte Schädigung durch chronische Hypoxie bzw. Ischämie und ein Beleg für die Auswirkung von kombinierter Hypoxie/Ischämie bzw. chronischer Hypoxie. Die Heraufregulation der NR1- und der NR2B-Untereinheiten könnte als Kompensationsversuch verstanden werden.  Dabei weist die Abnahme der NMDA-Rezeptorzahl auf eine Unterfunktion dieses Rezeptors hin, wie sie auch in der Pathophysiologie der Schizophrenie angenommen wird. Der Anstieg der leicht erregbaren NR2B-Untereinheit könnte als Verschiebung der Verhältnisse zugunsten leichter reagierender Untereinheiten verstanden werden. Die uneinheitliche Entwicklung der NR2C-Untereinheit könnte sowohl die unterschiedliche Qualität der Auswirkung von chronischer Hypoxie und kombinierter Hypoxie/Ischämie widerspiegeln, als auch die unterschiedliche Empfindlichkeit der Gehirnareale. Der Anstieg der NR2D-Untereinheiten, wobei wie bei schizophrenen Patienten vermehrt NR2D-Untereinheiten im Präfrontalen Cortex gefunden wurden, kann als weiteres Indiz verstanden werden, dass bei der Äthiopathogenese der Schizophrenie chronische Hypoxie bzw. kombinierte Hypoxie/ Ischämie beteiligt sein können. Offensichtlich besteht ein Zusammenhang zwischen chronischer Hypoxie bzw. Hypoxie/ Ischämie und morphologischen und quantitativen Veränderungen an NMDA-, AMPA- und GABAA-Rezeptoren. Es liegt nahe, die gemessenen PPI-Defizite als Folge der erwähnten Veränderungen anzusehen. Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse eine besondere Rolle von Hypoxie und Ischämie in einem vulnerablen Stadium der Gehirnentwicklung und weisen  auf eine mögliche Beteiligung an der Pathophysiologie der Schizophrenie hin. Die Versuchsergebnisse legen dar, dass Hypoxie oder Ischämie bei jungen Ratten meßbare Schäden an NMDA-, AMPA- und GABAA-Rezeptoren verursachen können, die auch bis zum Erwachsenenalter nicht ausgeglichen werden können. Diese Ergebnisse zeigen, dass chronische Hypoxie bzw. die Ischämie als Ursache sowohl für akute molekularbiologische Veränderungen im Hirn als auch für die späteren Störungen in der Reizverarbeitung anzusehen sind. Diese Ergebnisse werden auch durch die Literatur bestätigt. Daher erscheint dieses Tiermodell als geeignet, um den Zusammenhang von Verhaltensstörungen und Veränderungen an Rezeptoren  experimentell zu untersuchen. Und es ist geeignet, um mögliche Therapien der Schizophrenie und Prävention von Folgeschäden durch Sauerstoffmangel bei der Schwangerschaft und bei der Geburt experimentell an diesem Modell zu testen.  

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Starke, Manfred: Untersuchung der Wirkung von Hypoxie auf das glutamaterge System als Tiermodell für die Ätiopathogenese der Schizophrenie. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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