Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Nachweis von Salmonellen in natürlich und künstlich kontaminierten Lebensmitteln mittels kultureller Methode, ELISA, PCR und Microarray

Lubenow, Elmar

The current study investigated and compared the sensitivity and specificity of Salmonella detection by the conventional cultural method according to section 35 LMBG (Food and Consumer Goods Act), Tecra® uniqueTM Salmonella ELISA, PCR (Gene Scan), and biochip-based Microarray (NUTRI®-Chip). For investigating the sensitivity and specificity of the methods mentioned above, naturally as well as artificially contaminated food were used. Furthermore, pure bacteria cultures were examined. The artificially contaminated food samples used in the study were minced meat inoculated with Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium DT 104. The concentrations of bacteria amounted to a number of 1.2 to 9.2 Salmonella per gram of minced meat. Samples of 1 g, 10 g, and 25 g of inoculated meat were tested. With the object of visualising how consistently Salmonella and minced meat were mixed after inoculation, a method of colouring the minced meat with Brilliant Black was developed. It turned out that the optimum colouring was achieved by using 10 ml of 0.05% Brilliant Black solution on 80 g of minced meat. By means of the inoculation experiments, the respective detection threshold of the different detection methods could be determined. On the other hand, the influence of the non-selective enrichment stage on the quality of the test results was investigated by determining the respective minimum time for pre-enrichment. With the procedure for determination of the minimum time for pre-enrichment, a new comparing method has been developed. This method examines how long a sample of minced meat inoculated with 20 Salmonella needs to be incubated in a pre-enrichment broth to obtain a positive test result with the respective detection methods. Moreover, the detection threshold of the respective detection methods with elimination of the pre-enrichment process was established, using decimal dilutions of S. Typhimurium cultures. In addition, the detection threshold for mixtures of S. Typhimurium and E. coli cultures was determined for the Rappaport-Vassiliadis (RV) broth. The results of all these experiments are to be summarised as follows: In the tests for determination of the detection threshold, all the detection methods used led to positive results with any of the tested concentrations and any quantity of the samples. Excluding the pre-enrichment process, the following concentrations of Salmonella were necessary to obtain positive test results: < 1.6 Salmonella/ml for Selenite-Cystine (SV) broth (<16 Salmonella absolutely), 1.6 x 103Salmonella/ml for the molecular-biological detection methods (1.6 x 103Salmonella absolutely), 2.2 x 105Salmonella/ml for the ELISA (8.8 x 105Salmonella absolutely), and 2.2 x 106Salmonella/ml for the RV broth (2.2 x 105Salmonella absolutely). With mixtures of S. Typhimurium cultures and 104 or 108E. coli bacteria, the detection threshold when using RV broth was established at 2.5 x 101Salmonella/ml (2.5 Salmonella absolutely). The respective minimum time for pre-enrichment shows a clear distinction in sensitivity between the different methods. The minimum time for pre-enrichment was 60 minutes for the cultural method with an SC broth, 300 minutes for the molecular-biological detection methods, 330 minutes for the cultural method with an RV broth and 630 minutes for the ELISA. Besides showing differences in the sensitivity, the results of the newly developed method for determining the minimum time for pre-enrichment indicate the potential of rationalising the respective detection methods by reduction of the non-selective pre-enrichment stage. In comparing different naturally contaminated food samples, the test results of the molecular-biological detection methods showed a high degree of correspondence (99.06%) to those of the cultural method. The values for sensitivity and specificity of the molecular-biological methods were 100% and 97.47%, respectively.   The Tecra® uniqueTM Salmonella ELISA tested positive on 10 out of 58 food samples without confirmation by the cultural method and the molecular-biological methods. There was 81.03% agreement between the results of the ELISA and those of the cultural method. In comparison with the other detection methods, the new NUTRI®-Chip proved to have a higher-than-average sensitivity and specificity with artificially as well as naturally contaminated food samples. These qualities make it a routinely applicable, safe method for the detection of Salmonella in food. An additional important advantage of the NUTRI®-Chip is its capability of detecting several different pathogenic microorganisms at the same time.  

Die vorliegende Arbeit diente der vergleichenden Untersuchung auf Salmonellen mittels Kulturmethode gemäß §35 LMBG, Tecra®uniqueTMSalmonella ELISA, PCR (GeneScan®) und Biochip-basiertem Microarray (NUTRI®-Chip) hinsichtlich der Sensitivität und der Spezifität. Für die Sensitivitäts- und Spezifitätsuntersuchungen wurden künstlich und natürlich kontaminierte Lebensmittel verwendet. Außerdem wurden Untersuchungen mit Bakterien-Reinkulturen durchgeführt. Als künstlich kontaminiertes Lebensmittel wurde Hackfleisch mit Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhimurium Phagentyp DT 104 dotiert. Die Konzentrationen betrugen 1,2 bis 9,2 Salmonellen/g Hackfleisch. Untersucht wurden 1g-, 10g- und 25g-Proben des dotierten Hackfleisches. Zur Visualisierung des Durchmischungsgrades nach der Dotierung wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem das Hackfleisch mit dem Farbstoff Brillantschwarz eingefärbt wurde. Hierbei stellte sich heraus, dass eine optimale Färbung von 80 g Hackfleisch mit 10 ml einer 0,05%igen Brillantschwarzlösung erreicht wurde. Anhand der Dotierungsversuche wurden zum einen die Nachweisgrenzen der verschiedenen Nachweisverfahren bestimmt, zum anderen wurde der Einfluss der nicht-selektiven Voranreicherung auf die Qualität des Untersuchungsergebnisses durch die Bestimmung der Mindest-Voranreicherungszeit untersucht. Mit dem Verfahren zur Bestimmung der Mindest-Voranreicherungszeit wurde eine neue Vergleichsmethode entwickelt, bei der untersucht wurde, wie lange eine mit 20 Salmonellen dotierte Hackfleischprobe in einem Voranreicherungsmedium inkubiert werden muss, um mit einem bestimmten Nachweisverfahren ein positives Untersuchungsergebnis zu erhalten. Darüber hinaus wurden die Nachweisgrenzen der verschiedenen Nachweisverfahren unter Ausschluss des Voranreicherungsprozesses ermittelt. Hierzu wurden Dezimalverdünnungen von S. Typhimurium-Kulturen verwendet. Für die Rappaport-Vassiliadis -(RV-)Anreicherung wurde außerdem die Nachweisgrenze mit Mischungen aus S. Typhimurium- und E. coli-Verdünnungen bestimmt. Die Ergebnisse der Untersuchungen können wie folgt zusammengefasst werden: Bei den Versuchen zur Bestimmung der Nachweisgrenze führten alle Verfahren bei allen untersuchten Konzentrationen und bei jeder Probenmenge zu positiven Untersuchungsergebnissen. Wurden die Nachweisgrenzen unter Ausschluss des Voranreicherungsprozesses ermittelt, waren folgende Salmonellenkonzentrationen für ein positives Untersuchungsergebnis erforderlich: <1,6 Salmonellen/ml für die Selenit-Cystin-(SC-) Anreicherung (<16 Salmonellen absolut), 1,6 x 103 Salmonellen/ml für die molekularbiologischen Nachweisverfahren (1,6 x 103 Salmonellen absolut), 2,2 x 105 Salmonellen/ml für die ELISA-Methode (8,8 x 105 Salmonellen absolut) und 2,2 x 106 Salmonellen/ml bei Verwendung der RV-Anreicherung (2,2 x 105 Salmonellen absolut). Bei Mischungen aus S. Typhimurium-Kulturen mit 104 oder 108E. coli-Bakterien lag die Nachweisgrenze mit der RV-Anreicherung bei 2,5 x 101 Salmonellen/ml (2,5 Salmonellen absolut). Deutliche Sensitivitätsunterschiede konnten anhand der ermittelten Mindest-Voranreicherungszeiten festgestellt werden. Die Mindest-Voranreicherungszeit für den kulturellen Salmonellennachweis mit der SC-Anreicherung betrug 60 Minuten, für die molekularbiologischen Nachweisverfahren 300 Minuten, für den kulturellen Nachweis mit der RV-Anreicherung 330 Minuten und für den Nachweis mit dem ELISA 630 Minuten. Neben der Darstellung der Sensitivitätsunterschiede geben die Ergebnisse der neu entwickelten Vergleichsmethode zur Bestimmung der Mindest-Voranreicherungszeit einen Hinweis darauf, wie groß das Rationalisierungspotential eines Nachweisverfahrens durch eine Verkürzung der nicht-selektiven Voranreicherung ist. Bei dem Vergleich verschiedener natürlich kontaminierter Lebensmittelproben wurde festgestellt, dass die Untersuchungsergebnisse der molekularbiologischen Nachweisverfahren eine hohe Übereinstimmung (99,06%) mit den Ergebnissen des kulturellen Salmonellennachweises aufwiesen. Die ermittelten Sensitivitäts- und Spezifitätswerte der molekularbiologischen Methoden betrugen 100% bzw. 97,47%. Der Tecra®uniqueTMSalmonella ELISA führte bei 10 von 58 Lebensmittelproben zu positiven Untersuchungsergebnissen, die weder mit dem Kulturverfahren noch mit den molekularbiologischen Methoden bestätigt werden konnten. Der Übereinstimmungsgrad der ELISA-Ergebnisse mit denen der Kulturmethode betrug 81,03%. Der neuartige NUTRI®-Chip zeigte im Vergleich mit den übrigen Nachweisverfahren sowohl bei den Dotierungsversuchen, als auch bei den Feldprobenuntersuchungen eine überdurchschnittliche Sensitivität und Spezifität. Daher stellt dieses Nachweisverfahren eine praxistaugliche und sichere Methode zum Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln dar. Darüber hinaus bietet der NUTRI®-Chip durch die Möglichkeit zum parallelen Nachweis mehrerer unterschiedlicher pathogener Mikroorganismen einen weiteren bedeutenden Vorteil.  

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Lubenow, Elmar: Untersuchungen zum Nachweis von Salmonellen in natürlich und künstlich kontaminierten Lebensmitteln mittels kultureller Methode, ELISA, PCR und Microarray. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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