Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung boviner Darmepithelzellen

Pickartz, Stephanie

Aim of the present study was to develop a method to establish primary cultures of bovine intestinal epithelial cells as well as establish and characterize these primary cultures. Crypt epithelial cells are target cells for BVD-virus in mucosal disease of cattle and are destroyed by apoptosis. Thus primary cultures of intestinal epithelial cells should help to study the molecular mechanisms of virus-induced cell death. Small intestine was collected from 26 bovine fetuses aged 4.5 to 7.5 months. The mucosa was removed mechanically and digested by enzymes to isolate epithelial cells. Different methods of isolation using trypsin, thermolysin and a combination of collagenase and dispase were compared. The highest numbers of proliferating enterocytes were obtained by using the combination of collagenase and dispase for cell isolation. Fetuses older than 6.5 months were not suitable, because epithelial cells did not proliferate in culture. Since cultured cells were a mixture of epithelial cells and fibroblasts, several methods were used during cultivation and subcultivation to gain epithelial cell cultures of high purity. Collagen S was used as extracellular matrix and improved the epithelial cells´ adhesion and proliferative activity. Different steps of preincubation, selective removal of fibroblasts by trypsination and the addition of collagenase to the culture medium reduced the fibroblast cell population further. In four cultures the combination of these methods resulted in an increase of epithelial cells to almost 100 %. The cells from these four cultures were characterized by immunohistology, enzymehistology and –biochemistry, ultrastructural examinations and measurement of their proliferative capacity. The majority of cells in all four cultures were of epithelial origin and reacted to pan-cytokeratin antibodies. A further distinction between proliferative crypt and differenciated villus cells based on expression of cytokeratin 8 and cytokeratin 19 was not possible. The cultures could be cultivated and subcultivated (6 to 12 passages) for varying amounts of time. The decrease in proliferation, which was determined by the expression of the cell cycle-associated Ki-67 antigen, reflected the limited life-span of the enterocytes. Cell cultures which had been preserved for a longer period showed a reduced and finally no activity in the formazan cell proliferation assay. Ultrastructural investigations demonstrated a cell population growing in colonies, not forming a monolayer, without junctional complexes, rudimentary microvilli and some tight junctions. In contrast to the presence of lactase, aminopeptidase, alkaline phosphatase and saccharase-isomaltase in the freshly obtained mucosa of fetal intestine, epithelial cells in culture did not possess any of these enzymes. Using optimized methods for cell isolation, culture and subcultivation primary cell cultures were established. The cells in these cultures exhibited characteristics of undifferenciated crypt cells which can be distinguished from fully differenciated villus cells by their proliferative activity.  

Ziel der vorliegenden Arbeit war, eine Methode zur Herstellung von Primärkulturen von Darmepithelzellen des Rindes zu erarbeiten, sowie diese Primärkulturen zu etablieren und zu charakterisieren. Kryptepithelzellen sind Zielzellen des BVD-Virus bei der Mucosal Disease des Rindes und gehen durch Apoptose zugrunde. Primärkulturen der Epithelzellen sollen bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der virusinduzierten Zellzerstörung helfen. Von 26 Rinderfeten im Alter von 4,5 bis 7,5 Monaten wurde der Dünndarm entnommen, die Mukosa mechanisch entfernt und zur Isolierung der Epithelzellen einem enzymatischen Verdau zugeführt. Vergleichsweise kamen hier Trypsin, Thermolysin und eine Mischung aus Kollagenase und Dispase zur Verwendung. Die optimale Methode zur Gewinnung möglichst vieler lebensfähiger Enterozyten war der kombinierte Kollagenase/Dispase-Verdau. Ältere Feten (ab 6,5 Monaten) waren ungeeignet, da keine kultivierbaren Epithelzellen angezüchtet werden konnten. Die Kultivierung erfolgte mit RPMI-Medium und einem Zusatz von 5 % fetalem Kälberserum. Da die Zellpopulationen sowohl aus Epithelzellen als auch aus Fibroblasten bestanden, wurden im Verlauf der weiteren Kultivierung und Passagierung mehrere Anreicherungsverfahren eingesetzt, um möglichst reine Epithelzellkulturen zu erhalten. Die Beschichtung der Kulturgefäße mit Kollagen S verbesserte die Adhäsion und teilweise auch Proliferationsaktivität der Epithelzellen. Vorinkubationsschritte, selektive Trypsinierung der Fibroblasten und Zugabe von Kollagenase zum Medium dienten ebenfalls der Verdünnung der Fibroblastenpopulation. Durch die Kombination dieser Verfahren konnte der Epithelzellanteil in vier Kulturen auf nahezu 100 % gesteigert werden. Die Zellen dieser vier Kulturen wurden mit immunhistologischen, enzymhistologischen und –biochemischen, ultrastrukturellen und proliferationsmessenden Methoden chrakterisiert. Die Mehrzahl der Zellen in den vier Kulturen waren epithelialer Herkunft, da sie mit dem pan-Zytokeratinantikörper reagierten.  Mit Cytokeratin 19 und 8 ließ sich keine genauere Zuordnung zum proliferationsaktiven Krypt- oder ausdifferenzierten Villusepithel treffen. Die Kulturen konnten unterschiedlich lange kultiviert und passagiert (6 – 12 Passagen) werden. Die begrenzte Lebensspanne der Zellen spiegelte sich in der sinkenden Proliferationsrate wider, die durch die Expression zellzyklusassoziierten Ki67-Antigens bestimmt wurde. Auch zeigten die nach längerer Konservierungsdauer nicht mehr anwachsenden Zellkulturen eine verminderte und letztlich ausbleibende Stoffwechselaktivität im Formazantest. Die raster- und transmissionselektronischen Untersuchungen stellten eine in nesterartigen Kolonien wachsende Zellpopulation dar, die keinen organisierten Monolayer mit junctional complexes bildete, jedoch über Mikrovilli und partiell auch tight junctions verfügte. Im Gegensatz zu der im Darm noch vorhandenen Enzymexpression der Zellen erwiesen sich die Epithelzellen in Kultur als gänzlich frei von Laktase, Aminopeptidase, alkalische Phosphatase, und Saccharase-Isomaltase. Die nach Optimierung von Isolierungsmethode, Kulturbedingungen und Anreicherungsverfahren erhaltenen Zellen entsprechen in ihren Charakteristika also den undifferenzierten Kryptepithelzellen, die im Vergleich zum ausgereiften Villusepithel noch proliferationsaktiv sind.  

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Pickartz, Stephanie: Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung boviner Darmepithelzellen. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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