Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Regulation der anaeroben Nitratreduktasen von Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG

Puncken, Axel

In this study, the narGHJI gene cluster was cloned from a genomic library of BCG and compared to the isolated gene cluster of M. tuberculosis with focus on the capability to produce nitrite in fastgrowing M. smegmatis as well as in a slow-growing deletion mutant of M. bovis BCG. The gene cluster of M. tuberculosis shows much more reductase activity than BCG. DNA sequence analyses of a 500 bp fragment in both species was done. The fragment lies before of the translation start sequence of narG. Since there was just a single mismatch between both sequences (215 bp upstream of the translation start) a site directed mutagenesis was performed in the gene cluster of M. tuberculosis to exchange the base thymidine for cytosine, as it is present in BCG at the same location. Consequently, a considerable decrease of nitrite production of the altered M. tuberculosis gene cluster was observed. Apparently, the regulating mechanism for gene expression of the anaerobe nitrate reductase must be located in this region. The fact that M. tuberculosis shows nitrate reductase activity while M. bovis BCG does not, leads to the assumption that there must be at least one further nitrate reductase in M.tuberculosis. Since the vaccine strain BCG was developed from M. bovis, this species was also tested for the exsistence of a nitrate reductase activity under anaerobe growing conditions. To isolate the narGHJI gene cluster, it was necessary to construct a genomic library of M. bovis first. The isolated gene cluster was able to transfer the capability to reduce nitrate to slow-growing species of M. smegmatis. Its activity was on the level of BCG. Sequence analyses of the 500 bp fragment which is located before the translation start of narG was done in M. bovis as well. There was no difference found to the corresponding sequence of BCG. Whether there is a connection between a higher virulence in M. tuberculosis than in BCG or M. bovis and a higher nitrate reductase activity in M. tuberculosis has not been fully solved and remains an assumption.  

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das narGHJI-Gencluster aus der genomischen Bibliothek von BCG isoliert und mit dem isolierten Gencluster der anaeroben Nitratreduktase aus M. tuberculosis hinsichtlich seines Nitritbildungsvermögens sowohl in dem schnellwachsenden Mykobakterienstamm M. smegmatis als auch in langsamwachsenden Deletionsmutanten von M. bovis BCG verglichen. Das Gencluster aus M. tuberculosis ist in der Lage, erheblich mehr Nitrit zu bilden als dasjenige aus BCG. Mit Hilfe von Sequenzanalysen wurde daraufhin die DNA beider Mykobakterienspezies im Bereich von 500 bp vor dem Translationsstart von narG analysiert. Ein Unterschied in der Sequenz von nur einer Base (215 bp vor dem Translationsstart von narG) zwischen M. tuberculosis und BCG veranlasste uns dazu, eine gezielte Punktmutation an genau dieser Stelle durchzuführen. In dem narGHJI-Gencluster aus M. tuberculosis wurde die Base Thymin gegen die Base Cytosin, die sich an der entsprechenden Stelle im narGHJI-Gencluster von BCG befindet, ausgetauscht. Die ehemals hohe Nitratreduktaseaktivität des narGHJI-Genclusters aus M. tuberculosis nahm daraufhin erheblich ab. Es ist also zu vermuten, dass sich an dieser Stelle regulatorische Mechanismen für die Genexpression der anaeroben Nitratreduktase befinden, die auf einen Promotorbereich zurückzuführen sein könnten. Die Tatsache, dass M. tuberculosis im Gegensatz zu BCG auch unter aeroben Bedingungen eine Nitratreduktaseaktivität aufweist, deutet darauf hin, dass M. tuberculosis über mindestens eine weitere Nitratreduktase verfügen könnte. Da der als Impfstamm verwendete Stamm BCG aus der Spezies Mycobacterium bovis entwickelt worden ist, wurde auch diese Spezies auf das Vorhandensein einer Nitratreduktase untersucht, die unter anaeroben Bedingungen vermittelt wird. Es war zunächst erforderlich, eine Genombibliothek von M. bovis zu erstellen, aus der das narGHJI-Gencluster isoliert werden konnte. Es zeigte sich, dass dieses isolierte Gencluster in der Lage ist, eine Nitratreduktaseaktivität auf den schnellwachsenden Stamm M. smegmatis zu übertragen. Die Höhe der Aktivität liegt auf dem Niveau von BCG. Die DNA von M. bovis wurde ebenfalls in einem Bereich von 500 bp vor dem Translationsstart von narG sequenziert. Es wurde kein Unterschied zu der Sequenz von BCG gefunden. Ob es einen Zusammenhang zwischen der stärkeren Virulenz von M. tuberculosis gegenüber BCG und auch M. bovis und der höheren Nitratreduktaseaktivität dieses Stammes gibt, ist bis heute nicht geklärt und kann daher nur vermutet werden.  

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Puncken, Axel: Untersuchungen zur Regulation der anaeroben Nitratreduktasen von Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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