Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunhistologische Untersuchungen zur Expression variabler Oberflächenantigene von Mycoplasma bovis und zur Immunreaktion in der Lunge von experimentell infizierten Rindern

Buchenau, Inka

Mycoplasma bovis is one of the most important causative agents of bovine mycoplasmosis world-wide, being responsible for considerable economic losses. The most important diseases caused by this pathogen are pneumonia and arthritis of calves and cattle as well as mastitis in cows. Since the variation of defined surface proteins (Vsps and pMB67) has been shown in vitro, it is under discussion that antigen variation in the host, i.e. in lung tissue, may be involved in the persistence of the agent in the respiratory tract. So far an effective, commercially available vaccine does not exist and the knowledge about the immune reactions in the host following an infection is insufficient. The aim of this study was to investigate the occurrence and distribution of variable surface protein antigens in vivo by means of monoclonal antibodies (clones 4D7, 1A1, 1E5, 2A8 and I2) and immunohistological methods, and to characterise the numbers and distribution of T-lymphocytes (CD3, CD4, CD8) and B-lymphocytes (CD79a) in the lung, particularly in the proliferated BALT of calves following experimental infection with Mycoplasma bovis. In three experiments (A, B and C) 21 conventionally reared calves aged between three and five weeks were inoculated intratracheally with mycoplasma broth. The animals of experiment A were given a clonal variant of type strain PG 45, the calves of the experiments B and C were infected with Mycoplasma bovis strain 1067. One animal of experiment A and two animals of each of the experiments B and C which were inoculated intratracheally with sterile mycoplasma broth served as negative control animals. The calves of experiment A were euthanased two, four, six and ten days after inoculation, the animals of the experiments B and C after three weeks. Paraffin embedded tissue samples of all animals as well as frozen tissue samples of the animals of experiments B and C from six defined areas of the lung were available for examination. The pneumonic changes seen at histological examination in all infected calves mainly corresponded to the lung alterations known to be caused by M. bovis. Furthermore, obliterative bronchiolitis could be observed in three animals (experiments B and C), an alteration not described for M. bovis until now. The immunohistological results of this study with the monoclonal antibodies 4D7, 1A1 and 1E5 suggest that antigen variation of Vsps does occur in vivo in the lung tissue of infected calves. Using the monoclonal antibody I2, the expression of the variable surface protein pMB67 was demonstrated in vivo. Most of the proliferated BALT was found in the cranial areas of the lung. Lymphoid aggregates outnumbered lymphoid follicles with germinal centres. With increasing duration of the infection (experiments B and C), an increase in the number of BALT foci and lymphoid follicles was noticed. At this stage of infection, the formation of lymphoepithelium was stated. The observation that in animals from experiments B and C the increase of the BALT was more severe than in animals from experiment A supports the hypothesis that ongoing stimulation by Mycoplasma bovis in the lungs of infected calves induces the proliferation of the peribronchial lymphatic tissue and the development of germinal centres. CD3 positive lymphocytes was the main lymphocyte type in the lung. They were found in the alveolar walls as well as in the periphery of the BALT. Of the T-cell subsets, CD4 positive cells clearly outnumbered CD8 positive cells. The latter were seen mainly in the parenchyma of the lung and only rarely in the BALT. CD79a positive cells were predominantly found in the centre or the periphery of the BALT but also in larger numbers around necrotic areas of the lung parenchyma. To better understand the interactions between Mycoplasma bovis and the hosts immune system, especially with regard to the development of an effective vaccine, further investigations are needed for characterizing the subpopulations of T-helper cells, the cytokines produced by these cells and the possible role of innate immunity associated with macrophages.

Mycoplasma bovis ist einer der weltweit bedeutendsten Erreger boviner Mykoplasmosen, die mit erheblichen wirtschaftlichen Verlusten einhergehen. Die wichtigsten Krankheitsbilder, die von diesem Erreger verursacht werden, sind Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und Jungrindern sowie Mastitis bei Kühen. Da in vitro gezeigt wurde, dass Mycoplasma bovis variable Oberflächenproteine (Vsps und pMB67) exprimiert, wird diskutiert, dass eine im Lungengewebe des Wirtes erfolgende Antigenvariation an der Persistenz des Erregers im Respirationstrakt beteiligt ist. Ein wirksamer, kommerziell erhältlicher Impfstoff ist bislang nicht verfügbar und die Kenntnisse über die auf die Infektion folgenden Immunreaktionen im Wirt sind unzureichend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Auftreten und die Verteilung variabler Oberflächenproteinantigene in vivo mittels monoklonaler Antikörper (Klone 4D7, 1A1, 1E5, 2A8 sowie I2) und immunhistologischer Methoden zu untersuchen sowie die Anzahl und Verteilung von T-Lymphozyten (CD3, CD4, CD8) und B-Lymphozyten (CD79a) in der Lunge unter besonderer Berücksichtigung des BALT bei experimentell mit Mycoplasma bovis infizierten Kälbern zu charakterisieren. In drei Versuchen (A, B und C) wurden 21 konventionell gehaltene Kälber im Alter von drei bis fünf Wochen intratracheal mit Mycoplasma bovis inokuliert. Den Tieren des Versuches A wurde hierbei eine klonale Variante des Mycoplasma bovis Typ-Stammes PG 45 verabreicht, die Kälber der Versuche B und C wurden mit dem Mycoplasma bovis Stamm 1067 infiziert. Ein Tier aus Versuch A und jeweils zwei Tiere der Versuche B und C, denen steriles Kulturmedium intratracheal inokuliert worden war, dienten als negative Kontrolltiere. Die Tötung der Tiere erfolgte im Versuch A nach zwei, vier, sechs bzw. zehn Tagen, in den Versuchen B und C drei Wochen nach der Infektion. Von allen Tieren standen paraffineingebettete Lungengewebeproben, von den Kälbern der Versuche B und C zusätzlich tiefgefrorene Proben aus sechs definierten Lokalisationen der Lunge zur Verfügung. Die histologisch bei den infizierten Kälbern festgestellten pneumonischen Veränderungen entsprachen im Wesentlichen den bei Mycoplasma bovis Infektionen bereits bekannten Lungenalterationen. Darüber hinaus wurden bei drei Tieren (Versuche B und C) obliterierende Bronchiolitiden beobachtet, eine bisher bei Rindern mit respiratorischer Mycoplasma bovis Infektion nicht beschriebene Veränderung. Die immunhistologischen Untersuchungsergebnisse mit den monoklonalen Antikörpern 4D7, 1A1 und 1E5 sprechen für eine in vivo auftretende Variabilität der Vsps im Lungengewebe infizierter Kälber. Mit dem monoklonalen Antikörper I2 konnte die Expression des Oberflächenproteins pMB67 in vivo nachgewiesen werden. Das proliferierte BALT war vermehrt in kranialen Bereichen der Lunge zu beobachten. Es lag häufiger in Form lymphoidzelliger Aggregate als in Form von Lymphfollikeln mit Keimzentrum vor. Mit zunehmender Infektionsdauer (Versuche B und C) konnte eine Zunahme der BALT-Foci und eine vermehrte Lymphfollikelbildung bemerkt werden. Auch die Bildung von Lymphepithel war in diesem Stadium der Infektion festzustellen. Die bei den Tieren der Versuche B und C gegenüber denen des Versuches A festgestellte stärkere Zunahme des BALT unterstüzt die bislang diskutierte Hypothese, dass ein länger andauernder, von Mycoplasma bovis ausgehender Stimulus in den Lungen von Kälbern zur Proliferation des peribronchiolären lymphatischen Gewebes und zur Keimzentrumbildung führt. In den untersuchten Lungen konnten überwiegend CD3-positive Lymphozyten festgestellt werden, die sowohl in den Alveolarsepten, als auch in der Peripherie des BALT anzutreffen waren. Bei den T-Zell Subtypen fiel das eindeutige Überwiegen CD4-positiver Zellen gegenüber CD8-positiven Zellen auf. Letztere lagen hauptsächlich im Parenchym der Lunge und nur selten im BALT. CD79a-positive Zellen waren überwiegend im Zentrum oder der Peripherie des BALT anzutreffen, aber auch in der Peripherie nekrotischer Areale des Lungenparenchyms konnten zahlreiche CD79a-positive B-Lymphozyten und Plasmazellen beobachtet werden. Um die Interaktionen zwischen Mycoplasma bovis und dem Immunsystem des Wirtes nicht zuletzt im Hinblick auf die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes besser verstehen zu können, bedarf es weitergehender Untersuchungen, wobei unter anderem die nähere Charakterisierung der beteiligten Subpopulationen von T-Helferzellen bzw. der von ihnen produzierten Zytokine sowie die Rolle der in der Lunge auftretenden Makrophagen als Zellen der unspezifischen Immunantwort zu berücksichtigen wären.

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Buchenau, Inka: Immunhistologische Untersuchungen zur Expression variabler Oberflächenantigene von Mycoplasma bovis und zur Immunreaktion in der Lunge von experimentell infizierten Rindern. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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