Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Assessment of Salmonella contamination using an antibody-ELISA test and a PCR technique in pigs at slaughter and on farm level

Chaunchom, Sujate

Salmonella spp. are among the most important food-associated infective agents of intestinal diseases in humans. In several European countries monitoring programmes have been established to estimate the risk of infection from pork, for example by testing for Salmonella antibodies in samples of meat juice taken from abattoirs. Producers are classified in three categories according to the percent of seropositive animals determined in the slaughter house. Such a monitoring programme is planned for Germany, as well. However, the potential risk from delivery of animals carrying or shedding Salmonella at the abattoir and for meat as food cannot be judged solely on the basis of antibody titres. Proof of actual contamination of animals in the herd with Salmonella is necessary, as it is unclear what measures should be taken to avoid cross-contaminations before and during slaughter when a large proportion of the pigs are seropositive. The purpose of the present investigations was to compare the Salmonella antibody status of pigs at the abattoir with the actual degree of colonisation of the animals‘ intestines (jejunum) and tonsils by Salmonella spp. in order better to judge the usefulness of serological test results for estimating the risk of contamination. At the same time this study was intended to test the usefulness of classifying fattening farms as free of Salmonella, slightly or seriously contaminated, on the basis of serological status, and to discuss possible sources of contamination at the farm. Samples (diaphragm pillar muscle, jejunum and adhering lymph nodes) were taken on twelve slaughter days from 383 pigs from 32 different fattening farms. On four of the twelve days (days 9 through 12), samples were additionally taken from the tonsils of 129 slaughter pigs. The order in which the animals were delivered and slaughtered was noted on every sampling day. The samples of the diaphragm pillar muscle were frozen for subsequent assessment of the meat juice in antibody ELISA. Tissue samples of intestine, lymph nodes and tonsils were pre-enriched in buffered peptone water in preparation for the detection of Salmonella spp. by PCR. A total of 7.04 % (27 animals) of the slaughtered pigs were tested seropositive; these originated from 19 % (6 fattening farms) of the 32 suppliers. (Sixteen animals came from farm F13, five from F11, two from F20, and one each from F15 and F27.) A single supplier, F13, was the source of 59 % (16 animals) of the ELISA-positive animals. Salmonella DNA was detected in jejunum samples with adhering lymph nodes in 63 (16.4 %) of the pigs slaughtered. One third of these (21 animals) were supplied by farm F13. Although 15.5 % of the 129 tonsil samples were found to be positive by PCR, only 1 animal came from pigs supplied by farm F13. Salmonella DNA was also isolated from the jejunum samples of about 40 % (11 animals) of the seropositive pigs. On the other hand, only circa 17.5 % of the jejunum samples found to be positive by PCR correlated with the ELISA test. Positive antibody ELISA and/or Salmonella spp. were found in the organs on only seven of the twelve sampling days. Strikingly, the time when animals from the various farms were delivered and slaughtered had a considerable influence on the frequency of Salmonella findings over the course of the day. When animals from farms with high levels of positive antibody titres and PCR findings in organ samples were slaughtered at the beginning of the day, there was clear evidence of Salmonella spp. in intestine and tonsil samples. But when animals from contaminated farms were slaughtered at the end of the day, Salmonella were found only sporadically in the pigs from other farms slaughtered earlier in the day. After classification of the suppliers on the basis of the results of the meat juice antibody ELISA (cut-off OD % > 40), closer investigation was undertaken of one farm each classified as category I or II (with between 0 and 20 % seropositive animals, and between 20 and 40 %, respectively). Three blood samples were taken at different times from twenty animals from newly stocked herds in each of these farms and tested for antibodies with ELISA. In addition, environmental samples were taken in the stalls (swabs of surfaces, feed samples), as were samples of faeces, which were analysed with traditional microbiological methods for the presence of  Salmonella. In farm F11, 20 % of the blood sera collected on the first testing day were serologically positive, as were 25 % of the blood sera taken on days 2 and 3. In farm F13, on the other hand, there was no positive blood sample on day 1, and only 5 % were positive on days 2 and 3. This contradicts the prevalences determined by the meat juice samples for these farms, where the category I farm, F11, showed 9.4 % positive, and farm F13, category II, 29.1 %. All feed samples tested negative microbiologically, and only one collective faeces sample was positive (in farm F13). The results of this study show that the meat juice antibody ELISA is apparently only an insufficient indication of the actual contamination of the animals with Salmonella. More than twice as many pigs carrying Salmonella will be identified if the intestine (intestinal lymph nodes, material from the jejunum) are included in the investigation. These latent infections also increase the risk of unrecognised cross-contaminations at the abattoir when pigs afflicted with Salmonella are slaughtered at the beginning of the day. It is therefore necessary to know the pigs‘ antibody status at the production unit if at all possible. If this is not possible, then at least the animals‘ antibody status should be determined at the abattoir and linked to the suppliers. However, the findings also show that it is not enough to classify the fattening farms as to specific contamination categories solely on the basis of meat juice testing at the abattoir, because the antibody status of a herd can change dramatically every time the farm is restocked. This is particularly true when suppliers are changed frequently, and demonstrates the advantage of so-called integrated chains (with only one or a few, well-established suppliers). In farms not managed in accordance with the chain concept, animals should be tested in good time, at least a week before slaughter. This is essential for the recognition of risk and minimisation of contamination. Animals from units suspected of contamination should be slaughtered only at the end of the day, and the abattoir should be cleaned especially thoroughly and disinfected. It appears that close co-operation between producers, abbatoirs and public health authorities is necessary to break the chain of Salmonella contamination effectively. This is in the interest of animal owners and meat producers and will promote the health of both animals and consumers.

Salmonellen zählen zu den wichtigsten lebensmittelassoziierten Erregern von Darmerkrankungen des Menschen. Zur Einschätzung der Höhe des Risikos einer Infektion über Schweinefleisch sind in einigen europäischen Ländern Monitoring-Programme etabliert worden, die sich u.a. auf den Nachweis von Salmonellen-Antikörpern in Fleischsaftproben, die im Schlachtbetrieb gewonnen wurden, stützen. Die Erzeugerbetriebe werden aufgrund des prozentualen Anteils der im Schlachtbetrieb ermittelten seropositiven Tiere in drei Kategorien eingeteilt. Auch in Deutschland wird die Einführung eines solchen Überwachungsprogrammes geplant. Ob Schlachtschweine einer Anlieferungspartie jedoch tatsächlich Träger und Ausscheider von Salmonellen sind und damit potentiell ein Risiko im Schlachtbetrieb und für das Lebensmittel Fleisch darstellen, kann aufgrund des Antikörpertiters allein nicht beurteilt werden. Hierzu ist der Nachweis der tatsächlichen Belastung der Tiere mit Salmonellen im Bestand notwendig, zumal unklar ist, welche Massnahmen bei einem hohen Anteil an seropositiven Schweinen zu treffen sind, mit denen Kreuzkontaminationen vor und während der Schlachtung verhindert werden können.   Ziel der eigenen Untersuchungen war es, den Salmonellen-Antikörper-Status von Schweinen im Schlachtbetrieb mit der tatsächlichen Besiedelung des Darmes (Jejunum) und der Tonsillen der Tiere mit Salmonella spp. zu vergleichen, um die Eignung des serologischen Nachweises zur Risikoabschätzung besser beurteilen zu können. Gleichzeitig sollte auf diesem Weg die Zweckmäßigkeit der Einteilung von Mastbetrieben aufgrund des serologischen Status in Kategorien von frei oder gering bis hochgradig mit Salmonellen belastet überprüft und mögliche Eintragspfade in den Betrieb diskutiert werden.   An 12 Schlachttagen wurde Probenmaterial (Zwerchfellpfeiler, Jejunum mit anhaftenden Lymphknoten) von 383 Schlachtschweinen aus 32 verschiedenen Mastbetrieben gewonnen. An 4 der 12 Schlachttage (Tage 9 bis 12) wurden zusätzlich Gewebeproben aus den Tonsillen von 129 Schlachtschweinen genommen. Notiert wurde an jedem Probenahmetag die Reihenfolge der Anlieferung und Schlachtung der Tiere. Die Zwerchfellpfeilerproben wurden bis zur späteren Untersuchung des Fleischsaftes im Antikörper-ELISA eingefroren. Zum Nachweis von Salmonella spp. mittels PCR wurde Darm- und Lymphknoten- sowie Tonsillengewebe in gepuffertem Peptonwasser vorangereichert.   Insgesamt fanden sich 7,04 % (27 Tiere) seropositive Schlachtschweine, welche von 19 % (6 Betriebe: F13 = 16 Tiere, F11 = 5 Tiere, F20 = 2 Tiere, F15 und F27 = 1 Tier) der 32 anliefernden Mäster stammten. Von nur einem Mäster (F13) stammten dabei allein 59 % (16 Tiere) dieser ELISA-positiven Tiere. Bei 63 (16,4 %) Schlacht schweinen konnte mit der PCR Salmonellen-DNA in Jejunumproben mit anhaftenden Lymphknoten nachgewiesen werden; 21 Tiere, ein Drittel, kamen von Mäster F13. 15,5 % der 129 Tonsillenproben waren in der PCR positiv, jedoch stammte nur 1 Tier von den Schweinen des Mästers F13. Bei etwa 40 % (11 Tiere) der seropositiven Schlachtschweine konnte auch Salmonellen-DNA vom Jejunum isoliert werden. Andererseits korrelierten nur circa 17,5 % der in der PCR positiven Jejunumproben mit dem ELISA-Test. Nur an 7 der 12 Probenahmetage konnten positive Ergebnisse im Antikörper-ELISA und/oder Salmonellen in den Organen gefunden werden. Auffällig war, dass die Reihenfolge der Anlieferung und Schlachtung von Tieren aus verschiedenen Betrieben einen erheblichen Einfluß auf die Häufigkeit von Salmonellenfunden im Tagesverlauf hatte. Wurden Tiere aus belasteten Betrieben, in denen hohe positive Antikörpertiter gefunden und DNA Nachweise (PCR) in Organproben geführt worden waren, am Anfang des Tages geschlachtet, gab es auch deutliche Funde an Salmonellen in den Darm- und Tonsillenproben. Wurden dagegen Tiere aus belasteten Betrieben am Ende des Tages geschlachtet, so fanden sich Salmonellen auf den davor geschlachteten Schweinen anderer Betriebe nur sporadisch. Nach der Einstufung der Lieferbetriebe aufgrund der Ergebnisse des Fleischsaft-Antikörper-ELISA (cut-off OD % >40), wurde jeweils ein Kategorie I- (0 bis 20 % seropositive Tiere) und ein Kategorie II-Betrieb (20 bis 40 %) näher untersucht. Dabei wurden in jedem Betrieb dreimal zu verschiedenen Zeitpunkten Blutproben von jeweils 20 Tieren der neu eingestallten Herde auf Antikörper mittels ELISA untersucht. Zusätzlich wurden in den Ställen Umgebungsproben (Tupferproben von Oberflächen, Futterproben) und Kotproben genommen und mittels klassischer Mikrobiologie auf das Vorkommen von Salmonellen analysiert.   20 % der am 1. Untersuchungstag gesammelten Blutsera und je 25 % der Blutsera von Tag 2 und 3 in Betrieb F11 waren serologisch positiv. Dagegen waren im Betrieb F13 an Tag 1 kein Tier und an den Tagen 2 und 3 lediglich 5 % der Blutproben positiv. Dies steht im Gegensatz zu den über die Fleischsaftproben ermittelten Prävalenzen (F11: Kategorie I, 9,4 %; F13: Kategorie II, 29,1 %). Alle mikrobiologisch untersuchten Futterproben waren negativ, nur eine Faezessammelprobe erbrachte einen positiven Befund (F13).   Die Befunde dieser orientierenden Untersuchung zeigen, dass offenbar der Fleischsaft-Antikörper-ELISA die tatsächliche Belastung der Tiere mit Salmonellen nur un zureichend wiederspiegelt. Wird der Darm (Darmlymphknoten, Jejunummaterial) in die Untersuchungen einbezogen, werden mehr als doppelt so viele Salmonellenträger unter den Schweinen identifiziert. Wegen dieser latenten Infektionen wächst auch die Gefahr unerkannter Kreuzkontaminationen im Schlachtbetrieb, wenn zu Beginn des Schlachttages mit Salmonellen behaftete Schweine geschlachtet werden. Es ist daher notwendig, den Antikörperstatus der Schweine möglichst im Aufzuchtbetrieb zu kennen. Ist dies nicht möglich, ist zumindest der Antikörper-Staus der Tiere auf dem Schlachtbetrieb zu ermitteln und den Aufzuchtbetrieben zuzuordnen. Allerdings haben die Befunde auch gezeigt, dass die Zuordnung der Mastbetriebe zu den Belastungskategorien ausschließlich aufgrund der Fleischsaftprobenuntersuchungen im Schlachtbetrieb zu kurz greift, da sich der Antikörperstatus einer Herde mit jeder neuen Tierlieferung erheblich ändern kann. Dies trifft besonders bei häufig wechselnden Zulieferern zu und zeigt den Vorteil sog. integrierter Ketten (nur einer oder wenige, gut bekannte Zulieferer). In Ställen, die nicht dem Kettenkonzept folgen, sollte eine Beprobung der Tiere rechtzeitig, mindestens 1 Woche vor der Schlachtung erfolgen. Dies ist zur Risikoerkennung und Minimierung von Kontaminationen unumgänglich. So sollten die Tiere aus verdächtigen Betrieben ausschließlich am Ende des Schlachttages geschlachtet werden. Danach ist besonders sorgfältig zu reinigen und zu desinfizieren. Eine engere Zusammenarbeit zwischen Produzenten, Schlacht betrieben und Überwachungsbehörden erscheint notwendig, um die Kontamina tionsketten für Salmonellen wirksam zu unterbrechen. Dies liegt im Interesse der Tierhalter und Fleischproduzenten und wird sowohl der Gesundheit der Verbraucher als auch den Tieren zugute kommen.

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Chaunchom, Sujate: Assessment of Salmonella contamination using an antibody-ELISA test and a PCR technique in pigs at slaughter and on farm level. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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