Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss von Calcium Ionophor A23187 während der In-vitro-Fertilisation boviner Eizellen auf die präimplantative Embryonalentwicklung

Haenisch Woehl, Adriane

The aim of this study was to investigate whether the activation of cumulus oocyte complexes (COC) and denuded oocytes with Calcium Ionophor A23187 in the period between penetration of the spermatozoon and syngamy, has a positive effect on the subsequent early embryonic development. The experiments were devided in three parts: the first experimental extension concerned the investigation of the temporal progress of the in vitro fertilization dependent on the duration of maturation and the presence of cumulus cells around the oocytes. In the second part, the fertilized COC/oocytes were treated at different times with calcium-ionophore to investigate the possible effect of the treatment on cleavage and early embryonic development. In the third part the possibility of parthenogenetic development was examined under the conditions selected in the experiment II. This was done for a better interpretation of the results obtained in the second part. Fertilized oocytes and/or COCs were observed independent of its time of maturation first at three hours after insemination and the presence of pronuclei was observed at the earliest six hours after insemination. The male pronucleus was observed earlier than the female. The highest syngamy rates of oocytes and/or COC were reached between 18 and 21 hours after insemination. The presence of cumulus cells around the oocytes during the IVF accelerated the events of the fertilization in the period from 0 h to 3 h after insemination and increased the syngamy rate. There was no significant influence of the cumulus cells on the formation of a pronucleus, but there was a tendency for a higher rate of oocytes with a pronucleus in the COC-groups. A relatively shorter maturation time (24 h) had better fertilization advice and at the beginning of the IVF (6 – 9 h after insemination) a higher portion of COCs and/or oocytes with pronucleus were observed. The same effect was also observed in the development of a female pronucleus in COCs and/or oocytes that were fertilized. COCs for 24 h matured were also more quickly activated than COCs matured for 30 h. A treatment of fertilized COCs and/or oocytes 6 h after insemination with Ca-ionophore had no effect on the cleavage and blastocyst rate. The positive effect of a treatment with Ca-ionophore 12 h after insemination on the cleavage rate was observed only in the precence of cumulus cells. An effect of the cumulus cells regarding the blastocyst rate was shown in all treated groups at all activation times. Of the examined parameters, the presence of cumulus cells seems to be the most important factor, in order to enable a significant effect through the treatment with Ca-ionophor during the IVF. A significant influence of the time of maturation on the blastocyst rate was observed only in COCs when they were treated 8 h after Insemination in presence of Ca2+- and Mg2+-ions. There was no significant influence of the presence of Ca2+ and Mg2+-ions in the activation medium on the cleavage rate at all other examined activation times. The presence of these ions in the activation mediums had a significant effect on the blastocyst rate in the group COK24 when they were activated at 8 h post insemination. The presence of cumulus cells has exercised a positive effect regarding the inhibition of parthenogenetic activation. Although a part of the divided COCs and/or oocytes in the experiment II were parthenotes, in the experiment III no parthenogenetic embryonic development to the stage of blastocyst was observed. In conclusion, we found that through the treatment of in vitro matured COC with Ca-Ionophor 9 or 12 h after insemination, an increase of the development rate to blastocyst stage is possible when the time of maturation and the presence of the cumulus cells are considered.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den möglichen Einfluss einer Behandlung von Cumulus-Oozyten-Komplexen bzw. Oozyten mit Ca-Ionophor zu bestimmten Zeitpunkten nach ihrer In-vitro-Fertilisation auf die frühe Embryonalentwicklung zu untersuchen. Der erste Untersuchungsabschnitt bestand in der Bestimmung des zeitlichen Verlaufs von Spermienpenetration und Vorkernbildung bei in vitro gereiften Oozyten des Rindes in Abhängigkeit von der Reifungsdauer und dem Cumuluszellbesatz der Oozyten. Mit diesen Untersuchungen wurden die Zeitpunkte ermittelt, zu denen im zweiten Abschnitt der Arbeit mit Ca-Ionophor aktiviert werden sollte. Ziel des dritten Experimentes war es, die möglicherweise parthenogenetisch bedingte Blastozystenrate unter den im Experiment II gewählten Bedingungen zu untersuchen. Befruchtete Oozyten bzw. COK wurden, unabhängig von ihrer Reifungsdauer, ab drei Stunden nach Insemination beobachtet. Die Anwesenheit eines Vorkern wurde ab sechs Stunden nach Insemination nachgewiesen. Die männlichen Vorkerne bildeten sich früher als die weiblichen. Der Anteil Oozyten bzw. COK mit Syngamie erreichte sein Maximum zwischen 18 und 21 Stunden nach Insemination. Die Anwesenheit von Cumuluszellen an den Oozyten während der IVF beschleunigte die Ereignisse der Befruchtung im Zeitraum von 0 bis 3 Stunden nach Insemination und erhöhte die Syngamierate. Es konnte zwar kein signifikanter Einfluss der CZ auf das Auftreten eines Vorkernes festgestellt werden, aber tendenziell gab es einen höheren Anteil Oozyten mit einem Vorkern in den COK-Gruppen. Eine vergleichsweise kürzere Reifungszeit (24 h) hat eine bessere Befruchtungsrate und zu Beginn der IVF (6 – 9 h nach Insemination) einen höheren Anteil COK bzw. Oozyten mit Vorkern zur Folge. Der gleiche Effekt wurde auch bei der Bildung eines weiblichen Vorkerns bei COK bzw. Oozyten beobachtet, die nachgewiesenermaßen befruchtet waren. Die 24 h gereiften COK wurden gegenüber den 30 h gereiften auch schneller aktiviert. Eine Behandlung befruchteter COK bzw. Oozyten 6 h nach Insemination mit Ca-Ionophor hatte keinen Effekt auf die Teilungs- und Blastozystenrate. Der positive Effekt einer Behandlung mit Ca-Ionophor 12 h nach Insemination auf die Teilungsrate wurde nur in Anwesenheit von CZ beobachtet. Ein Effekt der CZ war auch bezüglich der Blastozystenrate in den behandelten Gruppen zu allen Aktivierungszeitpunkten nachweisbar. Von den untersuchten Parametern scheint die Anwesenheit von CZ der wichtigste Faktor zu sein, um eine signifikante Wirkung durch die Behandlung mit Ca-Ionophor während der IVF zu ermöglichen. Ein signifikanter Einfluss der Reifungszeit auf die Blastozystenrate wurde nur bei COK beobachtet, wenn die Behandlung 8 h nach Insemination und die Aktivierung in Anwesenheit von Ca- und Mg-Ionen erfolgte. Ein signifikanter Einfluss der Anwesenheit von Ca2+- und Mg2+-Ionen im Aktivierungsmedium auf die Teilungsrate konnte zu keinem Aktivierungszeitpunkt nachgewiesen werden. Die Anwesenheit dieser Ionen im Aktivierungsmedium hatte nur in der Gruppe COK24 zum Aktivierungszeitpunkt 8h einen signifikanten Effekt auf die Blastozystenrate. Sie war deutlich höher bei den Gruppen, die in Medien mit Ca- und Mg-Ionen aktiviert wurden. Cumuluszellen haben einen positiven Effekt bezüglich der Hemmung der parthenogenetischer Aktivierung. Obwohl ein Teil der geteilten COK bzw. Oozyten im Experiment II Parthenoten waren, wurde im Experiment III keine parthenogenetische Embryonalentwicklung bis zum Blastozystenstadium beobachtet.

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Haenisch Woehl, Adriane: Untersuchungen zum Einfluss von Calcium Ionophor A23187 während der In-vitro-Fertilisation boviner Eizellen auf die präimplantative Embryonalentwicklung. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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