Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Candidate gene analysis for the bilateral convergent strabismus with exophthalmus in German Brown cattle

Hauke, Gabi

The objective of this work was the molecular genetic evaluation of whether the candidate regions of the three human genes POLG (polymerase gamma), SLC25A4 (solute carrier family 25, member 4) and C10orf2 (chromosome 10 open reading frame 2) were linked with bilateral convergent strabismus with exophthalmus (BCSE) in German Brown cattle. Therefore, we determined the cytogenetic locations of these candidate genes in cattle by fluorescence in situ hybridization and confirmed these results with radiation hybrid mapping using the Roslin/Cambrige bovine RH panel. In this study POLG was assigned to BTA21q17-q22, C10orf2 to BTA26q13-q21 and SLC25A4 to BTA27q14-q15. Using these mapping results we performed a non-parametric linkage analysis with 27 linked markers from the MARC/USDA gene-map equidistantly spread over the three bovine chromosomes BTA21, BTA26 and BTA27. Additionally, we developed 8 gene-associated microsatellite markers out of the gene harbouring bovine BAC clones and included them into linkage analysis. The total marker set consisted of 35 microsatellite markers with a mean pair-wise distance of 8.21 cM, a mean number of 6 alleles and an average polymorphism information content value of 54%. We used this marker set for the analysis of 154 German Brown cattle from 36 families segregating for BCSE. We were not able to show significant linkage between any of the microsatellites used and the disease phenotype. Therefore, we exclude BTA21, BTA26 and BTA27 harbouring responsible genes for BCSE.

Einleitung Bilaterales konvergierendes Schielen in Verbindung mit Hervortreten der Augäpfel aus der Orbita ist eine weit verbreitete Erbkrankheit, welche seit Ende des neunzehnten Jahrhunderts in vielen Rinderrassen beschrieben wurde. Die Fixierung der Augäpfel in dieser Position führt zu einer Konvergenz der beim Rind normalerweise leicht divergierenden Sehachse. Das Krankheitsbild manifestiert sich meist erst im frühen Erwachsenenalter und verläuft in der Regel progressiv. Hochgradige Fälle können zur Erblindung und damit zu Problemen bei der Haltung dieser Tiere führen. BCSE tritt in sporadischen Fällen, oder familiär gehäuft auf. Auf Grund der Erblichkeit der Erkrankung sollten betroffene Rinder nicht zur Zucht herangezogen werden, woraus wirtschaftliche Verluste für den Landwirt resultieren. Mittels komplexer Segregationsanalysen konnte ein autosomal dominantes Hauptgen als wahrscheinlichste Ursache des BCSE nachgewiesen werden (DISTL 1993). Das verursachende Gen ist bislang unbekannt. Auf Grund der starken Ähnlichkeit des BCSE mit der progressiven externen Ophthalmoplegie des Menschen (PEO), wurden die für die PEO verantwortlichen Gene Polymerase gamma (POLG), Chromosome 10 open reading frame 2 (C10orf2) und Solute carrier family 25, member 4 (SLC25A4) als Kandidatengene für den BCSE beim Rind ausgewählt. Das Ziel dieser Arbeit war es eine mögliche Kopplung dieser drei Kandidatengene mit dem BCSE beim Deutschen Braunvieh mittels flankierender Mikrosatelliten zu überprüfen. Dafür wurden die Lokalisierung der drei Kandidatengene zunächst mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zytogenetisch bestimmt und durch die Ergebnisse einer RH-Kartierung mit dem Roslin/Cambridge bovine RH panel bestätigt. Basierend auf diesen Kartierungsergebnissen konnten gleichmäßig über die entsprechenden Kandidatengen-tragenden Chromosomen verteilte Mikrosatelliten aus der MARC/USDA Genkarte ausgewählt werden. Nach Subklonierung und Sequenzierung der bovinen BAC-Klone wurden weitere Kandidatengen-flankierende Marker entwickelt. Das gesamte Markerset wurde für eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse verwendet.   Molekulargenetische Kartierung der Kandidatengene Für die Isolierung der Kandidatengen-tragenden bovinen BAC-Klone wurde die genomische Rinder-BAC-Bank mittels orthologer 32P-radioaktiv markierter humaner IMAGE-cDNA-Klone entsprechend der RPCI-Standardprotokolle durchmustert. Die humanen IMAGE-Klone wurden vom RZPD (http://www.rzpd.de) bezogen und beinhalteten die cDNA der entsprechenden Kandidatengene. Positive bovine BAC-Klone wurden ausgewählt und deren DNA mit Hilfe des Qiagen Midi plasmid Kits entsprechend dem modifizierten Protokoll für BACs (Qiagen, Hilden) isoliert. Die BAC-DNA-Enden wurden mit Hilfe des ThermoSequenase-Kits (Amersham Pharmacia, Freiburg) auf dem automatischen Sequenziergerät LI-COR 4200L sequenziert. Um die Übereinstimmung der BAC-DNA mit dem humanen IMAGE-Klon zu überprüfen, wurde eine ECL-Hybridisierung mit Hilfe des ECLTM direkt labeling and detection Kit (Amersham Biosciences, Freiburg) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde die BAC-DNA mittels des Restriktionsenzyms SacI verdaut und die Probe auf einem 0,8% Agarosegels elektrophoretisch aufgetrennt und für die Hybridisierung auf eine Nylonmembran übertragen.   Zytogenetische Kartierung mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung Für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf GTG-gebänderten Chromosomen wurden bovine Metaphasenchromosomen Phytohämagglutinin stimulierter Blutlymphozyten eines gesunden Bullen genutzt. Die Präparation der Metaphasen erfolgte nach zytogenetischen Standardtechniken. Vor der Hybridisierung wurden die GTG-gebänderten Chromosomen digital photographiert. Die Identifikation der Chromosomen erfolgte entsprechend der ISCNDB (2000). Die DNA der BAC-Klone wurden digoxigenin-markiert und auf den GTG-gebänderten Rinderchromosomen hybridisiert. Als Kompetitor, zum Binden repetitiver Sequenzen, wurde gescherte genomische Rinder DNA und Lachssperma-DNA eingesetzt. Die Signale der über Nacht hybridisierten Proben wurden mit dem Digoxigenin-FITC Detection Kit detektiert. Die Chromosomen wurden mit DAPI und Propidiumiodid gegengefärbt, um das Auffinden der Metaphasen zu erleichtern und mit Antifade eingedeckt, um ein schnelles Ausbleichen der Präparate zu verhindern. Mittels eines Fluoreszenzmikroskops wurden die zuvor photographierten Metaphasen wieder aufgesucht und auf Signale überprüft.   RH-Kartierung Zur Bestätigung der zytogenetischen Ergebnisse wurde das Roslin/Cambridge bovine RH-panel der Research Genetics (Huntsville, Ala.,USA), verwendet. Für jedes Kandidatengen wurde ein positiver BAC-Klon ausgewählt und ein Primerpaar aus den BAC-Endsequenzen entwickelt. Zwei unabhängige PCR-Reaktionen wurden durchgeführt. Die PCR-Produktauftrennung erfolgte auf einem 2% Agarosegel. Die PCR-Produkte wurden mittels UV-Licht sichtbar gemacht und von zwei Untersuchern unabhängig von einander ausgewertet. Mit Hilfe der entsprechenden Software (RHMAP3.0 package) erfolgte eine Zwei-Punkt-Analyse gegen etwa 1200 vorher auf diesem Panel typisierte bovine Mikrosatelliten.   Ergebnisse und Diskussion Das bovine POLG-Gen wurde auf dem Rinderchromosom BTA21q17-q22, das C10orf2-Gen auf BTA26q13-q21 und das SLC25A4-Gen auf BTA27q14-q15 über FISH kartiert. Diese Lokalisierung konnte durch die RH-Ergebnisse bestätigt werden. Das POLG-Gen zeigte in der Zwei-Punkt-Analyse eine enge Kopplung zu dem Marker IDVGA45 auf BTA21. Das C10orf2-Gen konnte in unmittelbarer Nähe des Mikrosatelliten BM1314 auf BTA26 und das SLC25A4-Gen zu BMS2650 auf BTA27 kartiert werden. Die Kartierungsergebnisse stimmen auf allen drei Chromosomen mit der bekannten Syntäniebeziehung zwischen HSA15 mit Teilen von BTA21, HSA10 mit BTA26 und HSA4q mit Teilen von BTA27 überein und sind daher als sehr sicher zu beurteilen.         Nicht-parametrische Kopplungsanalyse mittels Mikrosatelliten Familienmaterial Für die nicht-parametrische Kopplungsanalyse standen 154 Rinder der Rasse Deutsches Braunvieh aus 36 für BCSE segregierenden Familien zur Verfügung. Insgesamt umfaßten die Familien 405 Tiere, von denen 83.7% phänotypisch auf BCSE untersucht wurden. Die Prävalenz der Erkrankung innerhalb dieses Familienmaterials betrug 29.2%. Die durchschnittliche Familiengröße lag bei 11.25 Tieren, der durchschnittliche Verwandtschaftskoeffizient betrug 17.5%. Die DNA-Isolierung aus dem Blut bzw. Sperma dieser Tiere erfolgte mit dem Nucleon-BACC2-Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg).   Markerentwicklung, Genotypisierung und Auswertung Aus den bovinen BAC-Klonen, die jeweils ein Kandidatengen enthielten, wurden Mikrosatelliten Marker entwickelt. Dazu wurde die DNA der verschiedenen BAC-Klone isoliert, mittels Restriktionsverdau in Fragmente zerlegt, und diese dann auf einem 0.8%igen Agarosegel getrennt. Die Fragmente wurden für die Vermehrung in das Plasmid pGEM-4Z subkloniert. Rekombinante Plasmid DNA wurde mit dem ThermoSequenase sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) auf dem automatischen Sequenziergerät LI-COR 4200L aufgetrennt. Die Sequenzdaten wurden mit dem Sequencher 4.0.5 (Gene Codes, Ann Arbor, MI, USA) analysiert. Die Suche nach Mikrosatelliten erfolgte mit dem Repeat Masker (http://repeatmasker.genome.washington.edu/). Insgesamt konnten acht gen-assozierte Mikrosatelliten in den jeweiligen BAC-Klonen gefunden werden. Aus den flankierenden Sequenzen wurden Mikrosatellitenprimer mittels des Gene Fisher Programms (http://bibiserv.techjak.uni-bielefeld.de) entwickelt. Für die chromosomenweite Suche nach weiteren gekoppelten Markern wurden 27 gleichmäßig über die Chromosomen BTA21, BTA26 und BTA27 verteilte Mikrosatelliten aus der etablierten Genkarte der MARC/USDA (http://www.marc.usda.gov/genome/genome.html) für die Studie ausgewählt. Die verwendeten Marker hatten einen durchschnittlichen Abstand von 8,21 cM. Alle 35 Mikrosatelliten wurden unter identischen PCR-Bedingungen (Inkubation bei 94°C für 4 Minuten, 35 Zyklen für 30s bei 94°C, 60s Annealing-Temperatur, 30s bei 72°C und 10 Minuten bei 4°C) amplifiziert und nach Verdünnung mit Formamid-Ladepuffer elektrophoretisch auf einem LI-COR 4200L aufgetrennt. In der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse wurden 35 Mikrosatelliten auf Kosegregation mit dem BCSE-Phänotyp untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte mit der MERLIN Software Package (http://www.sph.umich.edu/csg/ abercasis/Merlin).   Ergebnisse und Diskussion Das in dieser Studie verwendete Markerset bestand aus 35, über die Chromosomen BTA21, BTA26 und BTA27 verteilten Mikrosatelliten. Die Marker besaßen eine durchschnittliche Anzahl von 6 Allelen und einen durchschnittlichen PIC-Wert von 54%. Mit Hilfe dieses Markersets war es nicht möglich eine signifikante Kopplung zwischen einem der untersuchten Mikrosatelliten und dem Phänotyp der Krankheit nachzuweisen. Daher können die untersuchten Kandidatengenregionen und die Chromosomen BTA21, BTA26 und BTA27 als Träger des für BCSE verantwortlichen Gens ausgeschlossen werden.   Schlußfolgerungen Mit dieser Studie konnten sowohl die Kandidatengenregionen der Gene POLG, C10orf2 und SLC25A4 als auch die Chromosomen BTA21, BTA26 und BTA27 als Träger des für den BCSE beim Braunvieh verantwortlichen Gens ausgeschlossen werden. Eine weiterführende, genomweite, alle bovinen Autosomen umfassende Untersuchung könnte die Identifizierung der mit dem BCSE-Phänotyp gekoppelten Chromosomenregion ermöglichen. Dafür sollten etwa 150 Mikrosatelliten, gleichmäßig über die verbleibenden 26 Rinderchromosomen verteilt, ausgewählt werden. Auf Grund der altersabhängigen Manifestation des BCSE ist die alleinige Verwendung betroffener Tiere in der Markerstudie anzuraten, um falsch-negative Phänotypen von der Analyse auszuschließen. Ein sicherer Ausschluß der Defektträger von der Zucht ist unbedingt notwendig, um eine weitere Verbreitung des BCSE, mit seinen gesundheitlichen Einschränkungen für die Tiere und finanzielle Einbußen für die Landwirte, zu verhindern. Die Kartierung des Genortes für BCSE kann dann als ein erster Schritt zur Entwicklung eines Mutationstests für Zuchttiere gesehen werden.

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Hauke, Gabi: Candidate gene analysis for the bilateral convergent strabismus with exophthalmus in German Brown cattle. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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