Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur genetischen Disposition für die Peptidoglykan-Polysaccharid-induzierte chronische Enterokolitis und Arthritis bei der Ratte

Hopf, Sonja

The human inflammatory bowel diseases (IBD), Crohn´s disease and ulcerative colitis, are chronic inflammatory disorders of the intestinal tract with largely unknown etiology. There is evidence that the pathogenesis of these diseases involves complex interactions among genetic, immunological and environmental factors. A valuable experimental model of IBD for the analysis of genetic factors is the peptidoglycan-polysaccharide (PG-PS)-induced rat model of chronic granulomatous enterocolitis. In this model, inbred rat strains exhibit differential responses to injection of PG-PS polymers into the gut wall. LEW rats develop chronic enterocolitis and extraintestinal manifestations of hepatitis and arthritis, which are also known in human IBD, whereas F344 rats fail to develop chronic enterocolitis or systemic manifestations. The aim of this study was to identify chromosomal locations of genes that determine susceptibility to chronic enterocolitis and arthritis in this model system. For this purpose, 168 rats of a segregating (LEW x F344)F2-population were injected intramurally at seven different locations of the gut with PG-PS polymers extracted from group A streptococci. The phenotype of enterocolitis was determined by evaluating disease-related parameters such as gross gut score, liver weight, number of liver granulomas, white blood cell count and hematocrit 24 days after injection. Based on these correlating parameters an overall inflammatory score was assigned. As measurement of arthritis the change of rear ankle joint diameters was determined 17, 21 and 24 days after injection. Genotyping of F2 rats consisted of a genome-wide screen using 95 polymorphic microsatellite markers and was performed in two steps. Initially, a subset comprising 24% of the F2 rats with the highest overall inflammatory score and the 10% with the lowest overall inflammatory score were genotyped using all 95 markers. Similarly, a subset comprising 21% of the F2 rats with the highest arthritis values and the 10% with the lowest arthritis values were genotyped. In a second step, the remaining F2 rats were genotyped with those markers (n = 36) that showed evidence for linkage to any of the disease phenotypes. Linkage analysis was performed by using c 2 analysis, interval mapping and Kruskal-Wallis test. Linkage analysis revealed that susceptibility to PG-PS-induced chronic inflammation is under complex multigenic control. Interestingly, the quantitative trait loci (QTLs) regulating enterocolitis and correlated disease parameters (liver weight, liver granulomas, leukocytosis, anemia) are largely different from those determining arthritis in this model system. Interval mapping and Kruskal-Wallis test on the entire F2 data revealed significant linkages of the markers/marker intervals D8Arb6 - D8Rat156, D17Rat8 - D17Rat151 and D17Rat151 - D17Rat65 to enterocolitis and/or enterocolitis-correlated parameters. Significant linkages to arthritis were observed for markers/marker intervals D7Rat99 - D7Rat4, D10Rat26 - D10Rat26 and D17Rat151. These findings indicate that genes modulating enterocolitis are localized on rat chromosomes 8 and 17 (near the above-mentioned markers), whereas genes modulating arthritis are localized on rat chromosomes 7, 10 and 17. The susceptibility alleles were contributed by the LEW genome. It remains to be determined if there is a common QTL controlling susceptibility to enterocolitis and to arthritis on chromosome 17. With regard to the genetic dissection of human IBD, the results of this study suggest stratification of study populations in consideration of extraintestinal manifestations. Future studies in the rat should focus on fine mapping of the QTLs indicated and on identification of candidate genes. Subsequently, homologous regions and candidate genes can be explored for their relevance to human IBD and associated arthritis.

Bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) des Menschen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, handelt es sich um komplexe Erkrankungen, deren Ursachen weitgehend unbekannt sind. Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der CED. Für das Studium der genetischen Faktoren eignet sich besonders das Modell der Peptidoglykan-Polysaccharid (PG-PS)-induzierten Enterokolitis bei der Ratte, da genetisch determinierte Unterschiede in der Empfänglichkeit für die PG-PS-induzierte Erkrankung zwischen verschiedenen Inzuchtratten existieren. Ratten des Inzuchtstammes LEW entwickeln nach PG-PS-Injektion eine chronische, granulomatöse Enterokolitis mit systemischen Manifestationen wie Hepatitis und Arthritis, die in ähnlicher Form auch bei Menschen mit CED beobachtet werden; Ratten des Inzuchtstammes F344 sind hingegen resistent gegenüber diesen Entzündungen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die chromosomale Zuordnung von genetischen Loci, welche die Suszeptibilität für chronische Enterokolitis und Arthritis im oben genannten Modellsystem determinieren. Zu diesem Zweck wurden 168 Ratten einer segregierenden (LEW x F344)F2-Population an sieben verschiedenen Lokalisationen des Darmes subserosal mit PG-PS-Polymeren (aus der Zellwand von Gruppe A Streptokokken) injiziert, 24 Tage post injectionem getötet und mittels pathologischer Parameter phänotypisiert. Dabei wurden folgende Parameter erhoben: makroskopischer Enterokolitisscore, Lebergewicht, Anzahl der Lebergranulome, absolute Leukozytenzahl und Hämatokrit. Aus diesen miteinander korrelierenden Krankheitsmerkmalen wurde ein inflammatorischer Gesamtscore gebildet. Ferner wurde an den Tagen 0, 17, 21 und 24 post injectionem der Durchmesser der Sprunggelenke ermittelt, um den Schweregrad der Arthritis zu bestimmen. Im Anschluß an die Phänotypisierung erfolgte eine genomweite Genotypisierung der F2-Ratten mit Hilfe von 95 polymorphen Mikrosatellitenmarkern. In der ersten Phase der Analyse wurden von den 168 Ratten der F2-Generation die 24% Tiere mit dem höchsten inflammatorischen Gesamtscore und die 10% Tiere mit dem niedrigsten inflammatorischen Gesamtscore unter Verwendung aller 95 Marker genotypisiert. Auf die gleiche Weise wurde mit den Tieren verfahren, bei denen extreme Arthritiswerte am Tag 24 post injectionem ermittelt worden waren; es wurden die 21% Tiere mit den höchsten Arthritiswerten und die 10% Tiere mit den niedrigsten Arthritiswerten herangezogen. In der zweiten Phase der Analyse wurden die übrigen F2-Tiere mit den 36 Markern genotypisiert, die bei den Tieren mit phänotypischen Extremwerten Hinweise auf eine Kopplung mit der Erkrankung lieferten. Zur Identifizierung der chromosomalen Lokalisation von Enterokolitis- bzw. Arthritis-modulierenden Genen wurde mittels c 2-Test, Intervallkartierung und Kruskal-Wallis-Test geprüft, ob Kopplungen zwischen genetischen Markern und Krankheitsmerkmalen bei den F2-Ratten vorlagen. Die Kopplungsanalyse zeigte, daß mehrere Genloci (QTLs, quantitative trait loci) an der Regulation der Suszeptibilität für PG-PS-induzierte Entzündungen beteiligt sind, wobei die Suszeptibilität für Enterokolitis und damit korrelierte Krankheitsmerkmale (Lebergewicht, Lebergranulome, Leukozytose, Anämie) weitgehend durch andere QTLs determiniert wird als die Arthritisuszeptibilität. Die anhand der Gesamtpopulation erhobenen statistisch signifikanten Ergebnisse der Intervallkartierung und des Kruskal-Wallis-Tests ergaben Kopplungen der Marker bzw. Markerintervalle D8Arb6 - D8Rat156, D17Rat8 - D17Rat151 und D17Rat151 - D17Rat65 mit dem Merkmal Enterokolitis und/oder mit Enterokolitis-korrelierten Merkmalen sowie Kopplungen der Marker bzw. Markerintervalle D7Rat99 - D7Rat4, D10Rat26 - D10Rat26 und D17Rat151 mit dem Merkmal Arthritis. Diese Befunde lassen vermuten, daß Enterokolitis-modulierende Gene im Bereich der genannten Marker auf den Rattenchromosomen 8 und 17 sowie Arthritis-modulierende Gene im Bereich der genannten Marker auf den Rattenchromosomen 7, 10 und 17 liegen. Die suszeptibilitätsvermittelnden Allele waren in allen Fällen auf den Stamm LEW zurückzuführen. Ob den Kopplungsbefunden auf Chromosom 17 ein gemeinsamer QTL, der an der Regulation der Enterokolitis und Arthritis beteiligt ist, zugrunde liegt, kann im Rahmen dieser Arbeit nicht beantwortet werden. Im Hinblick auf die genetische Analyse der CED des Menschen legen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Stratifikation der Patientenkollektive unter Berücksichtigung des Auftretens von extraintestinalen Manifestationen nahe. Zukünftige Untersuchungen bei der Ratte sollten sich auf die Feinkartierung der ermittelten Suszeptibilitätsloci und die Identifizierung von Kandidatengenen konzentrieren. Im Anschluß daran können homologe Regionen und Kandidatengene auf ihre Relevanz bei den CED des Menschen inklusive der damit verbundenen Arthritiserkrankungen geprüft werden.

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Hopf, Sonja: Untersuchungen zur genetischen Disposition für die Peptidoglykan-Polysaccharid-induzierte chronische Enterokolitis und Arthritis bei der Ratte. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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