Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende Expressionsstudien zur physiologischen und patho-physiologischen Relevanz der mCLCA1- und mCLCA2-Chloridkanäle bei der Maus

Horstmeier, Bettina Andrea

The recently discovered CLCA gene family contains an increasing number of members in various mammalian species. These complex transmembrane molecules appear to be involved in the transmembrane flux of anions, particularly Cl-, that is crucial for the secretion and absorption of ions and water in virtually all epithelial tissues. In addition to this physiological role, several CLCA members have been implicated in disease processes where they may modulate or compensate the basic defect in distorted epithelial secretion and absorption (including cystic fibrosis or mucoviscidosis and asthma). This speculated pathophysiological significance makes them interesting candidates for novel therapeutic approaches. The objective of this study was to quantitatively investigate the tissue expression patterns for mCLCA1 and mCLCA2, the first discovered murine CLCA family members. Therefore, a real time reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was established which discriminates between both homologs. Furthermore, the cellular and subcellular localization of both homologs was examined by immunohistochemistry using antibodies that were generated for that purpose. The following results were obtained: The RT-qPCR allowed a precise quantitation of the mCLCA1- and mCLCA2-expression. The method was characterized by a high sensitivity, specificity and reproducibility. The RT-qPCR results showed that some tissues (spleen, lymph nodes, bone marrow, liver, aorta and adrenal gland) exclusively express mCLCA1 while other tissues (mammary gland, thymus and intestine) only express mCLCA2. The RT-qPCR results of fetal tissues revealed that nearly all fetal tissues express more mCLCA1 than mCLCA2, except for whole fetus 8.5 and 19 days post conception when expression of mCLCA2 predominates. The immunohistochemical results yielded specific staining patterns predominantly in cytoplasmic granules of epithelial cells including the respiratory tract and various glands. Specific patterns were also observed at the apical membranes of select epithelial cells with microvilli (renal proximal tubules, salpinx and uterus) and in spermatids as well as leydig cells. However, immunohistochemistry failed to discriminate between mCLCA1 and mCLCA2. The results show that the two putative chloride channels are expressed in a unique pattern in numerous epithelial and non-epithelial tissues. The initial working hypothesis was confirmed, according to which previous results on the mCLCA1 expression pattern had been misinterpreted due to cross-reactivity with the formerly unknown mCLCA2. Expression of mCLCA1 and mCLCA2 in various epithelia support their expected role in ion conductivity. However, their strong expression in various other tissues including lymphoid organs is also consistent with speculations on a regulatory role in apoptosis. The results are well compatible with hypothesis on a role of mCLCA1 and mCLCA2 in the pathogenesis of disorders with malfunctioning secretory and absorptive pathways. Several new questions arise with regard to the physiological and pathophysiological functional mechanisms of these CLCA homologs. The novel detection assays that were established in this study will be valuable tools in future research on the CLCA gene family.

Die CLCA-Genfamilie wurde erst kürzlich entdeckt und umfasst eine wachsende Zahl von Mitgliedern in verschiedenen Säugerspezies. Diese komplexen Transmembran-moleküle werden funktionell mit dem Strom von Anionen, besonders Cl-, in Verbindung gebracht, was für die Sekretion und Absorption von Ionen und Wasser in praktisch allen epithelialen Geweben des Körpers bedeutsam ist. Neben dieser physiologischen Bedeutung kommt verschiedenen Mitgliedern der CLCA-Genfamilie eine pathophysiologische Relevanz zu. Sie übernehmen offenbar bei Krankheiten mit gestörten Sekretions- und Absorptionsvorgängen (z.B. zystische Fibrose oder Mukoviszidose und Asthma) eine Rolle bei der Modulation und parzieller Kompensation des Basisdefektes, was sie zu interessanten Kandidaten für neue Therapieansätze macht. Ziel dieser Arbeit war es, anhand eines Mausmodells ein quantitatives, organ-spezifisches Expressionsmuster von mCLCA1 und mCLCA2, den beiden zuerst entdeckten CLCA-Mitgliedern der Maus, zu ermitteln. Dazu wurde eine Reverse Transkription-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) im real time-Modus etabliert, die sicher zwischen den beiden mRNA-Spezies dieser Homologe diskriminiert. Mit diesem Verfahren wurde ein weites Spektrum an Mausorganen untersucht. Anschließend wurde mittels Immunhistochemie und eigens dafür hergestellten Antikörpern ihre zelluläre und subzelluläre Lokalisation untersucht. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: Die etablierte RT-qPCR erlaubt die sichere Quantifizierung der mCLCA1- und mCLCA2-Expression. Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit aus. Aus den RT-qPCR-Untersuchungen ging hervor, dass in einigen Organen (Milz, Lymphknoten, Knochenmark, Leber, Aorta und Nebenniere) nahezu aus-schließlich mCLCA1 exprimiert wird, während in anderen Organen (Milchdrüse, Thymus und Darm) die Expression von mCLCA2 deutlich überwiegt. Die RT-qPCR-Untersuchungen fetaler Gewebe ergaben bis auf wenige Aus-nahmen (ganzer Fetus 8,5 und 19 Tage nach Konzeption) eine deutlich über-wiegende Expression von mCLCA1 in allen untersuchten Organen. Die immunhistochemischen Untersuchungen, die nicht zwischen mCLCA1 und mCLCA2 diskriminieren konnten, zeigten eine Expression in zahlreichen sekretorischen Epithelien (unter anderem respiratorisches Epithel und Drüsen-epithel), überwiegend in Form von zytoplasmatischen Granula. Darüber hinaus erfolgte der Proteinnachweis in apikalen Membranen zilierter Epithelzellen des renalen proximalen Tubulusepithels, des Salpinx und des Uterus sowie in Spermatiden und Leydigzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden mutmaßlichen Cl--Kanäle in einem jeweils spezifischen Muster in zahlreichen epithelialen und auch nicht-epithelialen Geweben exprimiert werden. Die eingangs aufgestellte Hypothese, wonach frühere Untersuchungen zu Fehlinterpretationen des Expressionsmusters von mCLCA1 geführt hatten, wurde eindeutig bestätigt. Während das Vorkommen von mCLCA1 und mCLCA2 in epithelialen Geweben ihre postulierte Funktion in der Ionenleitung unterstützt, trägt ihr umfangreiches Vorkommen in lymphatischen Organen zu Spekulationen bei, wonach auch eine Funktion in der Apoptose vorliegen soll. Auch mit bisherigen Hypothesen über die Beteiligung von mCLCA1 und mCLCA2 an der Pathogenese von Krankheiten mit gestörten Sekretions- und Absorptionsvorgängen sind die eigenen Ergebnisse gut vereinbar. Es ergeben sich jedoch zahlreiche neue Fragestellungen bezüglich der physiologischen und pathophysiologischen Funktionsmechanismen der CLCA-Homologe. Für ihre Aufklärung werden die in dieser Studie erarbeiteten Nachweismethoden hilfreich sein.

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Horstmeier, Bettina Andrea: Vergleichende Expressionsstudien zur physiologischen und patho-physiologischen Relevanz der mCLCA1- und mCLCA2-Chloridkanäle bei der Maus. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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