Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einflüsse von Glukokortikoiden und Makrophagen auf neutrophile Granulozyten im Hinblick auf die Endometritis puerperalis des Rindes

König, Torge

Puerperal endometritis is a disease in cattle of economical importance. Up to now there are only unsatisfactory therapeutic and prophylactic procedures. As part of a research project on bovine endometritis this work contributes to elucidation of mechanisms that take part in the pathogenesis of endometritis, thus focussing on function and immuno-phenotype of polymorphonuclear neutrophil granulocytes (PMN). In order to simulate periparturient stress and a glucocorticoid therapy the in-vivo effects of dexamethasone have been examined in cattle of different stages of reproduction. Direct effects of dexamethasone were examinded by means of cultivating isolated peripheral blood PMN together with dexamethasone in vitro. In order to examine uterine PMN we applied an in-vivo endometritis model: After administration of recombinant human interleukin-8 into the uterus, considerable amounts of PMN immigrated within 6 hours. They were quantified and characterized by means of their vitality, immunophenotype and functional properties using above all flow cytometry. This approach was performed with cattle treated with dexamethasone or placebo. Some of the results confirmed effects of dexamethasone: Remarkable changes in differential counts in particular leukocytosis due to selective neutrophilia accompagnied by eosinopenia. In addition we could document a strong basopenia. These dexamethasone effects were independent of the reproductive stage of the animals. In agreement with published data dexamethasone decreased the phagocytic capacity of blood PMN in vitro. Also reduced expression of the adhesion molecule L-selectin upon dexamethasone treatment of cyclic cattle has been shown. Presumably this leads to demargination of PMN from blood vessel endothelium and inforces the release of PMN from bone marrow, thus causing the observed neutrocytosis. Extending our research of L-selectin expression we showed that the observed decrease neither was due to a direct effect of dexamethasone nor to the glucocorticoid-induced mediator annexin-I. Moreover a presumed reduction of apoptosis by dexamethasone causing neutrophilia could be largely excluded in our experiments. In contrast to other models of inflammation the reduced expression of L-selectin by dexamethasone did not result in reduced but rather increased numbers of PMN migrating into the uterus. A reason for the unexpected results may be the temporarily enhanced expression of the adhesion molecule LFA-1 which is necessary for migration out of the vessels. Neutrophil granulocytes of cyclic cattle showed numerous immunophenotypic changes upon application of dexamethasone. However, these changes could only partially be reproduced when inducing parturition of periparturient cattle with dexamethasone. One of the major changes observed in vivo was a reduced expression of the PMN-specific Bo116-antigen in cyclic cattle. Interestingly, dexamethasone caused the reverse in vitro by enhancing the expression of Bo116-antigen by PMN. A more direct influence of dexamethasone on PMN may be concluded from our finding that reduction of the generation of reactive oxygen species (ROS) was observed for blood PMN from cyclic animals ex vivo and in vitro as well as for uterine PMN ex vivo. More direct actions of glucocorticoids as well as more indirect ones are indicated as we obtained concordant and discordant results from in-vitro vs. in-vivo assays as well as from cyclic vs. periparturient animals. This was supported by dexamethasone decreasing plasma concentrations of steroid hormones such as estrogen (estrous cows) and cortisol (independent of cow’s reproductive stage) both of which are known to act as immunomodulators. In order to approach more complex in-vivo situations influencing PMN such as their transmigration from blood vessels to the uterus, the modulatory effect of autologous macrophages on PMN was investigated in vitro. Firstly, two different procedures of generating macrophages from peripheral blood monocytes (MDM, monocyte derived macrophages) were compared as there’s no existing bovine cell line of macrophages. In our hands cultivating MDM in cell-culture-flasks turned out to be advantaged over the teflon-bag method. Such MDM were able to modulate the phenotype and function of autologous PMN independently of dexamethasone. Some of the modulatory influences of macrophages were similar to those observed with PMN harvested from the uterus (CD11b and IL-A110-antigen expression) while others were discordant such as the ROS-generation which decreased in vitro and was enhanced in vivo. These results suggest a modulation of migrating PMN by resident uterine macrophages. Regarding the published opinion on glucocorticoids having generally immunosuppressive influence our data indicate that they may act as well in a immunoprotective manner e.g. by enhancing the peripartal transmigration of blood PMN into the uterus, thus, enhancing the capacity to control uterine bacterial infections. The pathogenetic significance of these results including the modulatory influence of MDM on PMN merit further investigation such as modulation of pathogen specific receptors of macrophages, PMN and epithelial uterine cells, interactions between these cells as well as the influence of steroid hormones and relevant pathogen associated patterns.

Die Endometritis puerperalis ist eine wirtschaftlich bedeutende Erkrankung des Rindes, für die es bisher nur unbefriedigende Prophylaxe- und Therapieverfahren gibt. Als Teil eines wissenschaftlichen Gesamtkonzeptes trägt die vorliegende Arbeit dazu bei, Mechanismen aufzuklären, die pathogenetisch an der Entstehung der Endometritis beteiligt sind. Dabei stehen Funktionen und Immunphänotyp von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) im Mittelpunkt des Interesses. Zur Simulation von peripartalem Stress und einer therapeutischen Glukokortikoidbehandlung wurde die In-vivo-Wirkung von Dexamethason bei Rindern in verschiedenen Reproduktionsstadien untersucht. Um direkte Dexamethasoneffekte zu erfassen, wurden aus dem Blut isolierte PMN in vitro mit dem Glukokortikoid kokultiviert. Außerdem kam ein In-vivo-Endometritismodell zur Anwendung. Nach intrauteriner Applikation von rekombinantem humanen Interleukin-8 wurden eingewanderte PMN hinsichtlich Zellzahl, Vitalität, Immunphänotyp und Funktionalität vor allem mit Hilfe durchflusszytometrischer Verfahren charakterisiert. Die Vorbehandlung dieser Tiere mittels Dexamethason oder Placebo sollte Informationen über Glukokortikoid-bedingte In-vivo-Einflüsse auf uterine PMN bereitstellen. In dieser Arbeit konnten einige publizierte Dexamethason-Effekte bestätigt werden. So waren unabhängig vom Reproduktionsstatus massive Veränderungen des Differentialblutbildes festzustellen (Neutrozytose, Leukozytose, Eosinopenie). Zusätzlich konnte in dieser Arbeit eine Basopenie nachgewiesen werden. Als funktionelle Eigenschaft wurde die Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten in vitro wie beschreiben gehemmt. Als deutliche phänotypische Veränderung war auf PMN zyklischer Rinder wie aus der Literatur bekannt eine verminderte Expressionsdichte des Adhäsionsmoleküls L-Selektin ex vivo nachzuweisen. Diese führt vermutlich zur Demargination von PMN vom Gefäßendothel und zur verstärkten Freisetzung von PMN aus dem Knochenmark und bedingt so die beobachtete Neutrozytose. Erstmalig wurde in dieser Arbeit in vitro gezeigt, dass die L-Selektin-Expressionsminderung weder ein direkter Glukokortikoideffekt ist, noch der Glukokortikoid-induzierte Mediator Annexin-I diesen Prozess beeinflusst. Auch konnte die Apoptose-Modulation durch Dexamethason als eine weitere Ursache der Neutrozytose weitgehend ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zu publizierten anderen Entzündungsmodellen konnten trotz der verminderten L-Selektin-Expression auf Blut-PMN und Uterus-PMN im Zuge eines In-vivo-Endometritismodells bei Dexamethason-behandelten Tieren mehr neutrophile Granulozyten aus dem Uterus gewonnen werden als bei Placebo-behandelten Probanden. Dieses Phänomen könnte auf der beobachteten kurzzeitig gesteigerten Expression des Adhäsionsmoleküls LFA‑1 auf PMN beruhen, das für die Auswanderung der Zellen aus Blutgefäßen erforderlich ist. Neutrophile Granuloyzten von zyklischen Tieren zeigten nach Dexamethasonapplikation zahlreiche immunphänotypische Veränderungen, die bei peripartalen Kühen durch Geburtsinduktion mittels Dexamethason nur teilweise und ohne statistische Absicherung reproduziert werden konnten. Eine dieser Veränderungen war eine Expressionssenkung des PMN-spezifischen Bo116-Liganden auf PMN zyklischer Tiere. Dieser Ex-vivo-Befund stand im Kontrast zum Expressions-steigernden Dexamethasoneinfluss in vitro. Die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten durch PMN zyklischer Tiere wurde im Gegensatz dazu sowohl ex vivo (Blut- und Uterus-PMN) als auch in vitro gleichsinnig gesenkt. Dies ist als Hinweis auf einen direkten Glukokortikoideinfluss auf die Zellfunktion zu werten. Die teilweise zwischen in vitro und in vivo sowie zwischen zyklischen und peripartalen Tieren differierenden Resultate lassen vermuten, dass Glukokortikoide unter den komplexen In-vivo-Bedingungen neben direkten auch indirekte Effekte an PMN bewirken. So wurde als Nebeneffekt der Dexamethasonbehandlung die Konzentrationssenkung bekanntermaßen immunmodulierender Steroidhormone wie Östrogene (bei östrischen Kühen) und Kortisol (unabhängig vom Reproduktionsstatus) beobachtet. Um der komplexen In-vivo-Situation näher zu kommen, die PMN unter anderem im Zuge der Transmigration vom Blutgefäß in den Uterus erfahren, wurde der Einfluss autologer Makrophagen auf neutrophile Granulozyten in vitro untersucht. Mangels einer bovinen Makrophagen-Zelllinie wurden zunächst zwei Verfahren zur Gewinnung von Makrophagen aus Monozyten des peripheren Blutes (MDM) verglichen. Das effizientere Kultivierungsverfahren in Zellkulturflaschen wurde dem in Teflonbeuteln für die nachfolgenden Versuche vorgezogen. Die so gewonnenen Makrophagen modulierten PMN in vitro phänotypisch und funktionell unabhängig von Dexamethason. Die beobachteten Veränderungen verhielten sich teilweise gleichsinnig (Steigerung der Expression von CD11b und IL-A110-Ligand) und teilweise entgegengesetzt (Senkung der ROS-Bildung) zu den Migrations-bedingten Modulationen, die bei uterinen PMN im Endometritismodell zu beobachten waren. Trotzdem sind die Resultate als Hinweis zu bewerten, dass transmigrierende PMN unter anderem durch residente uterine Makrophagen moduliert werden. Die Resultate der vorliegenden Arbeit liefern weitere Beweise für immunmodulierende Glukokortikoidwirkungen, jedoch nicht nur immunsuppressiver, sondern auch immunprotektiver Art. So konnte gezeigt werden, dass Glukokortikoide nicht zur Störung der Transmigration von PMN in den Uterus und darüber zur erhöhten Empfänglichkeit der Tiere für eine uterine bakterielle Infektion führen sondern eher zu vermehrter Einwanderung von Granulozyten in den Uterus. Allerdings vermindern Glukokortikoide die bakterizide Kapazität zirkulierender und uteriner PMN. Die pathogenetische Bedeutung dieses Phänomens und der PMN-modulierenden Makrophageneffekte fordern weiterführende Forschungsaktivitäten. Sie sollten sich vor allem mit der Modulation pathogenspezifischer Erkennungsstrukturen von Makrophagen, PMN und Uterusepithelzellen sowie den Interaktionen zwischen diesen Zellpopulationen unter dem Einfluss von Steroidhormonen und Produkten relevanter Erreger beschäftigen.

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König, Torge: Einflüsse von Glukokortikoiden und Makrophagen auf neutrophile Granulozyten im Hinblick auf die Endometritis puerperalis des Rindes. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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