Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung von Laktat- und Pyruvatmessung im Plasma und Liquor cerebrospinalis zur Diagnostik von mitochondrialen Erkrankungen beim Hund

Löbert, Vanessa

Mitochondriopathies develop through damage of mitochiondrial- or nucleaer DNA causing functional disturbance of the mitochondrial metabolic pathways. The large variability of clinical signs in mitochondrial diseases is due to different kind and localization of defective genes as well as to varying affection of different organs. Mitochondrial malfunctions were found to be one of the major causes of human neurodegenerative and neurometabolic diseases. Also in small animal practice increased numbers of case reports describing mitochondriopathies occur. In dogs the main clinical manifestations are myopathies and in some breeds encephalopathies, which are accompanied by necrosis or calcification. A lactatacidosis can frequently be diagnosed in mitochondriopathies because of a disturbed oxygen metabolism accompanied by an increased consumption of pyruvate in the Krebscycle.  Abnormal concentrations of lactate and pyruvate could therefore be helpful for the verification of a mitochondriopathy. No reference values for lactate in the cerebrospinal fluid (CSF) and for pyruvate in blood and CSF exist for the dog. The purpose of the current present study was to determine reference values for pyruvate, lactate and the pyruvate/lactate ratio in the blood. In addition these values were measured also in the blood and CSF of dogs with defined diseases of the central nervous system. It should be determined if the method of the pyruvate measurement is suitable for the routine diagnostics in dogs. In preliminary experiments to establish a method for pyruvate measurement in dogs blood samples of 40 animals were taken to determine the best method of taking blood in samples respectively to find the best   time point removing proteins from these samples.  Lactate and pyruvate were also measured before and after freezing. 104 dogs with different diseases of the central nervous system (CNS), 20 neurologically healthy dogs and 6 dogs with exercise induced weakness were included. Blood sampling occurred before and under anaesthesia. A suitable test kit to measure pyruvate was the test kit purchased from sigma, for lactate the kit from Roche DIAGNOSTICS was used. Parameters such as the number of leukocytes and the content of glucose in blood and CSF as well as blood gas analysis from venous blood were correlated with lactate and pyruvate levels. The statistical evaluation was performed with SAS. Pyruvate levels had a high variation.  The method of taking blood samples only slightly affected the results. Congestion of veins resulted in slightly elevated lactate and   pyruvate levels compared to blood samples taken without congestion. The time point for the removement of proteins from blood samples is of importance for the pyruvate measurement. A delay of 5 minutes reduces statistically significantly the concentration of pyruvate (median 0.047 mmol/l). Freezing of blood samples is not to recommend, since pyruvate- and lactate concentrations drop distinctly. However, CSF samples can be kept frozen at -20°C. Pyruvate and lactate levels measured before or during anaesthesia did not differ significantly. Due to the high variation of the values further factors were evaluated: no influence of the total number of leukocytes and glucose in blood and CSF, of the blood gas analysis or the age and weight of the animals was detected.  Different CNS diseases did not differ statistically significantly, but dogs with disc protrusion are differed significantly from neurologically healthy dogs. Neurologically healthy dogs and patients with idiopathic epilepsy displayed nearly the same values. The highest lactate concentrations were measured in dogs with disc protrusion and inflammatory CNS diseases. In summary, only pyruvate concentrations higher than 0,42 mmol/l in blood samples and higher than 0,4 mmol/l in the CSF, lactate concentrations  higher than 9.5 mmol/l in blood samples and higher than 3.7 mmol/l in the CSF are suspicious for a mitochondriopathy. Increased values can also occur in other CNS diseases. The calculation of the pyruvate/lactate-ratio is not suitable for the clinical diagnosis of a mitochondriopathy, since a narrow ratio could also be detected in healthy dogs respectively in animals with other CNS diseases. Testing lactate and pyruvate after exercise in myopathies is more useful than determining these values in rested dogs. Due to the high variation and the low specificity of these values other diagnostic methods, like muscle biopsy and imaging techniques are still necessary to diagnose mitochondriopathies in vivo.

Unter einer Mitochondriopathie versteht man alle klinische Erscheinungsformen, welche durch eine Schädigung der mitochiondrialen- oder nukleären DNS und dadurch verursachten funktionellen Störungen der mitochondrialen Stoffwechselwege entstehen. Die große Variabilität der mitochondrialen Erkrankungen ist bedingt durch unterschiedliche Art und Lokalisation der zugrunde liegenden Gendefekte, sowie durch variierende Organmanifestationen. Mitochondriale Funktionsstörungen haben sich als eine der Hauptursachen neurodegenerativer und neurometabolischer Erkrankungen beim Menschen herausgestellt. Auch in der Kleintierpraxis werden gehäuft Mitochondriopathien als Ursache für Myopathien und bei einigen Rassen als Ursache für Enzephalopathien, die mit Nekrosen oder Verkalkungen einhergehen, beschrieben. Aufgrund unterschiedlicher Gendefekte, die einer mitochondrialen Erkrankung zugrunde liegen können, ist die klinische Manifestation sehr vielfältig. Betroffen sind vor allem Organe mit hohem Energiebedarf, wie Gehirn und Muskulatur. Eine Laktatazidose ist ein häufig anzutreffender Befund bei Mitochondriopathien. Diese resultiert aus einem gestörten Sauerstoffmetabolismus einhergehend mit erhöhtem Verbrauch von Pyruvat im Krebszyklus. Labordiagnostisch könnten daher veränderte Laktat- und Pyruvatwerte hilfreich bei der Abklärung sein. Für Laktat im Liquor cerebrospinalis (CSF) und für Pyruvat in Blut und CSF gibt es für den Hund keine Referenzwerte. In der vorliegenden Studie sollten Referenzwerte für Pyruvat, Laktat und das Pyruvat/Laktat-Verhältnis im Blut erhoben werden. Bei Hunden mit definierten Erkrankungen des zentralen Nervensystems sollten Werte vergleichend auch im CSF gemessen werden, um die Spezifität einer Veränderung der genannten Messwerte zur Diagnosestellung einer Mitochondriopathie erheben zu können. Zusätzlich sollte festgestellt werden, ob die Methode der Pyruvatmessung in Blut und CSF beim Hund für die Routinediagnostik geeignet ist. Um die Methode der Pyruvatmessung für den Hund zu etablieren, wurden in Vorversuchen von 40 Hunden Blutproben entnommen, um die beste Methode der Blutgewinnung bzw. den richtigen Zeitpunkt der Enteiweißung des Blutes festzustellen. Die Stabilität der Werte nach Tiefgefrierung und deren Reproduzierbarkeit wurde überprüft. 104 Hunde mit verschiedenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), 20 neurologisch gesunde Hunde und 6 Hunde mit anstrengungsabhängiger Schwäche wurden in die Untersuchungen einbezogen. Die Blutentnahmen erfolgten vor und in Narkose. Als  geeignete  Testverfahren für Pyruvat stellte sich ein Testkit der Fa.Sigma heraus, für Laktat wurde ein Kit der Fa. Roche-Diagnostics verwendet. Um Korrelationen mit anderen Parametern in Blut und CSF berechnen zu können, wurden die Leukozytenzahl und der Glukosegehalt in beiden Flüssigkeiten bestimmt, sowie eine Blutgasanalyse aus venösem Blut durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms SAS. Bei der Bestimmung von Pyruvat wurden starke Streuungen festgestellt. Die Technik der Blutentnahme beeinflusste die Resultate nur geringfügig. Nach Venenstauung waren die Werte sowohl bei der Laktat- als auch bei der Pyruvatmessung geringfügig höher als bei einer Blutentnahme ohne Venenstauung. Der Zeitpunkt der Enteiweißung ist für die Pyruvatbestimmung von Bedeutung. Erfolgt die Enteiweissung 5 Minuten nach der Blutentnahme, sinkt der Pyruvatspiegel statistisch signifikant (Median 0,047 mmol/l). Eine Aufbewahrung der Proben durch Tiefgefrierung ist nicht möglich bei Blutproben, da sowohl Pyruvat als auch Laktatspiegel deutlich absinken. CSF eignet sich zur Aufbewahrung bei –20°C. Statistisch unterschieden sich die Werte, die bei Blutentnahme vor bzw. in Narkose erfasst wurden, nicht signifikant. Bei Einzeltieren, die im Wachzustand unruhig waren, waren die Werte von Laktat und Pyruvat in Narkose deutlich niedriger.  Aufgrund der starken Streuung der Werte wurden weitere Einflussfaktoren untersucht: eine Korrelation konnte weder für das Alter, das Gewicht der Tiere, die Leukozytengesamtzahl in Blut und CSF, den Glukosespiegel, noch für die Blutgasanalyse festgestellt werden. Einzelne Krankheitsgruppen unterschieden sich nicht statistisch signifikant. Hunde mit Diskopathie unterschieden sich aber statistisch signifikant von klinisch gesunden Hunde. Bei neurologisch gesunden Hunden und Patienten mit idiopathischer Epilepsie wurde die geringste Streuung festgestellt. Die höchsten Laktatwerte wurden bei Hunden mit Bandscheibenvorfall und entzündlichen Erkrankungen des ZNS gemessen. Zusammenfassend können nur Pyruvatwerte, die über 0,42 mmol/l im Blut und über 0,4 mmol/l im CSF liegen, und Laktatwerte höher als 9,5 mmol/l im Blut und höher als 3,7 mmol/l im CSF als Hinweis für eine vorliegende Mitochondriopathie angesehen werden. Erhöhte Werte können auch unspezifisch in Einzelfällen bei anderen Erkrankungen des ZNS auftreten. Die Berechnung des Pyruvat/Laktatverhältnis eignet sich nicht für die klinische Diagnose, da ein enges Verhältnis auch bei gesunden Hunden bzw. bei anderen Erkrankungen errechnet werden konnte. Ein Belastungstest zur Abklärung von Myopathien und eine anschließende Laktat- und Pyruvatbestimmung ist aussagekräftiger als die Bestimmung von Ruhewerten. Aufgrund der starken Streuung und der geringen Spezifität leichtgradig erhöhter Werte sind weiterhin andere diagnostische Methoden, wie Muskelbiopsien und bildgebende Verfahren notwendig, um eine Mitochondriopathie als Verdachtsdiagnose in der Klinik stellen zu können. 

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Löbert, Vanessa: Etablierung von Laktat- und Pyruvatmessung im Plasma und Liquor cerebrospinalis zur Diagnostik von mitochondrialen Erkrankungen beim Hund. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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