Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Stabilisierung der Chromatinstruktur von Bullenspermien in Beziehung zu der konventionellen Spermatologie, der Bindungsfähigkeit im Ovidukt-Explant-Assay und der Fruchtbarkeit in vitro

Löhmer, Inken

The objective of this study was to investigate the chromatin structure stability of bovine spermatozoa in relation to conventional parameters of sperm quality, binding capacity in the Oviduct-Explant-Assay (OEA) and fertility in vitro (IVF). A modified fluorescence microscopical sperm chromatin structure assay (mfSCSA), recently developed at our institute on a separate project (Helms, unpublished), combined with a digital Image Analysis system, was used. The study was devided into several segments:   -          78 ejaculates of 39 bulls were examined in respect of the capability of resistence of their sperm-DNA against acid denaturation in situ using both the flowcytometric sperm chromatin structure assay (SCSA, Evenson et al. 1980a) as well as the modified fluorescence microscopical sperm chromatin structure assay (mfSCSA, Helms, unpublished). -          The reliability of the mfSCSA was examined by evaluating 59 slides a second time and by treating 48 identical ejaculates with the mfSCSA twice. -          The organs of three slaughtered bulls were used to examine the sperm chromatin status during the testical and epididymal passage. -          The influence of the preservation status on the results of the mfSCSA was evaluated from 14 ejaculates. -          90 ejaculates of 30 test bulls were examined by the mfSCSA in relation to their conventional semen parameters and their head morphology features under the differential interference contrast microscope. -          The percentage of chromatin-instable spermatozoa before and after Percoll-washing and in the sperm population that had bound to the oviductal explants in vitro was compared in six ejaculates. -          The ejaculates of five bulls with low (n = 2) and high (n = 3) portions of chromatin-instable spermatozoa were investigated concerning their in vitro fertilization capacity.   Following results were achieved:   -          There was a significant correlation between both methods (R = 0,66, p < 0,0001). The mean value of chromatin-instable cells in the SCSA was 4,6 % (± 2,1 %), in the mfSCSA 5,0 % (± 2,2 %). -          The reliabilty for the ejaculates treated twice with the mfSCSA was nearly as high (R = 0,88, p < 0,0001) as for the same slide (R = 0,89, p < 0,0001). -          Distinct differences in respect of the degree of condensation of the sperm chromatin in the different parts of the testicle, epididymis and seminal duct could be observed. -          There was no significant influence of cryopreservation on the mfSCSA-values. The results of the shock frozen samples were correlated with the mfSCSA-values of the native and cryopreserved ejaculates, but they also differed significantly. -          The mean mfSCSA-value of the second trial was 4,6 % (± 1,6 %) and there was no correlation found to the parameters of  the motility and the supravital staining. There was only a slight correlation to head morphology features. -          By comparing the two sperm populations in the differential interference contrast optic we found significant differences. Red spermatozoa showed more morphological head deviations (p < 0,01) und neck breaks (p < 0,0001) than green ones. -          We detected a significant reduction of chromatin defect spermatozoa in the sample after Percoll gradient centrifugation and in the population which had bound to the oviductal epithel compared to untreated ejaculates (p < 0,05). -          In the in vitro fertilization we could not find significant differences between the means of cleaving and blastocyst rates from all bulls in relation to the mfSCSA-values. By comparing the means of the IVF-values from the different bulls with each other, ejaculates with low contents of chromatin defect cells had significant higher cleaving rates (p < 0,05). The blastocyst rates were higher too, but not significantly (p = 0,057).   It can be concluded that the modified fluorescence microscopical sperm chromatin structure assay is a reliable test to detect sperm chromatin stability as an independent fertility relevant parameter in the bull.

Ziel dieser Arbeit war es, die Stabilität der Chromatinstruktur  von Bullenspermien in Beziehung zu den Parametern der konventionellen Spermatologie, der Bindungsfähigkeit im Ovidukt-Explant-Assay (OEA) und der Fruchtbarkeit in vitro (IVF) zu untersuchen. Anwendung fand dabei der im eigenen Institut etablierte modifizierte fluoreszenzmikroskopische Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA, Helms, unveröffentlicht) unter Verwendung eines Digital Image Analysis-Systems. Die Arbeit gliederte sich in verschieden Abschnitte:   -          78 Ejakulate von 39 Bullen wurden hinsichtlich der Widerstandsfähigkeit der Spermien-DNA gegenüber saurer Denaturierung in situ mit dem flowzytometrischen Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA, Evenson et al. 1980a) und mit dem modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA, Helms, unveröffentlicht) untersucht (Methodenvergleich). -          Die Reproduzierbarkeit des mfSCSA’s wurde durch doppelte Auswertung von 59 Proben und zweimalige Durchführung des mfSCSA’s an identischen Ejakulaten (n = 48) untersucht. -          Bei Schlachtorganen von drei Bullen wurde der Spermienchromatinstatus im Verlauf der Hoden- und Nebenhodenpassage untersucht. -          Der Einfluss des Konservierungsstatus auf die Ergebnisse des mfSCSA’s wurde bei 14 Ejakulaten getestet. -          Bei 90 Ejakulaten von 30 Testbullen wurde die Beziehung des mfSCSA’s zu konventionellen Samenparametern und zur Kopfmorphologie im Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskop untersucht. -          Der Prozentsatz chromatininstabiler Spermien vor und nach Percoll-Waschen sowie in der an Oviduktexplante in vitro gebundenen Spermienpopulation wurde bei sechs Ejakulaten verglichen. -          Ejakulate von fünf Bullen mit niedrigem (n = 2)  und hohem (n = 3) Anteil chromatininstabiler Spermien wurden hinsichtlich der In-vitro-Fertilisations-Kapazität untersucht.   Folgende Ergebnisse wurden erzielt:   -          Es gab eine signifikante Korrelation zwischen beiden Methoden (R = 0,66, p <  0,0001). Der Mittelwert für den Anteil chromatininstabiler Zellen im SCSA lag bei 4,6 % (± 2,1 %), im mfSCSA betrug er 5,0 % (± 2,2 %). -          Die Reproduzierbarkeit an einem in einem anderen Durchgang mfSCSA-behandelten Ausstrich war fast so hoch  (R = 0,88, p < 0,0001) wie am selben Ausstrich (R = 0,89, p < 0,0001). -          Anhand der mfSCSA-behandelten Ausstriche aus den verschiedenen Bereichen des Hodens, Nebenhodens und Samenleiters waren deutliche Unterschiede in Bezug auf den Kondensationsgrad des Spermienchromatins zu erkennen. -          Es konnte kein signifikanter Einfluss der Tiefgefrierkonservierung auf die mfSCSA-Ergebnisse festgestellt werden. Die Werte der schockgefrorenen Proben waren zwar mit den mfSCSA-Daten der nativen und kryokonservierten  Ejakulate korreliert, unterschieden sich aber dennoch signifikant von ihnen. -          Der mittlere mfSCSA-Wert der Testbullenejakulate lag bei 4,6 % (± 1,6 %), und es konnte keine Korrelation zu den Parametern der Motilität und Supravitalfärbung gefunden werden. Es gab nur eine schwache Beziehung zu den Morphologiekriterien. Auch zu den Parametern der DICM konnte keine Korrelation gefunden werden. -          Unabhängig davon konnten im Vergleich der beiden Spermienpopulationen in der Differenz-Interferenz-Kontrast-Optik signifikante Unterschiede gefunden werden. Chromatininstabile Spermien zeigten mehr Kopfformabweichungen  (p < 0,01) und Halsbrüche (p < 0,0001) als chromatinstabile. -          Es gab eine signifikante Reduktion chromatindefekter Spermien in  der Percoll-gewaschenen und in der an das Oviduktepithel gebundenen Spermienpopulation (p < 0,05) im Vergleich zum unbehandelten Ejakulat. -          In der IVF konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Teilungs- und Blastozystenraten aller Bullen in Bezug zu den mfSCSA-Werten gefunden werden. Im Vergleich der Mittelwerte der IVF-Ergebnisse der einzelnen Bullen untereinander, zeigten die Ejakulate mit niedrigen Gehalten an chromatindefekten Spermien signifikant höhere Teilungsraten (p < 0,05). Die Blastozystenraten waren ebenfalls höher, jedoch nicht signifikant (p = 0,057).   Es wird geschlussfolgert, dass der mfSCSA einen reproduzierbaren Test zur Untersuchung der Stabilität des Spermienchromatins als einen eigenständigen, fertilitätsrelevanten Parameter beim Bullen darstellt.

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Zitierform:

Löhmer, Inken: Stabilisierung der Chromatinstruktur von Bullenspermien in Beziehung zu der konventionellen Spermatologie, der Bindungsfähigkeit im Ovidukt-Explant-Assay und der Fruchtbarkeit in vitro. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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