Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Der Mikrotubuli-abhängige Transport verschiedener Tegumentprotein-Mutanten des Herpes-Simplex-Virus-Typ 1 von der Plasmamembran zum Zellkern

Schmidt, Simone

Herpes simplex virus type 1 (HSV1) is the best characterized herpesvirus and belongs to the human pathogenic a-herpesviruses. a-herpesviruses cause lytic infections of epithelial cells of the mucosa and establish lifelong latent infections in sensoric and vegetative nerve ganglia. Latent herpesvirus can be reactivated by stress to a lytic infection, thus causing many human and animal diseases. HSV1 enters the cells by fusion of the viral envelope with the plasma membrane.  The viral capsid and the tegument proteins, localized between the capsid and the viral envelope, are released into the cytosol. The capsids are transported along microtubules (MT) by the MT-motor dynein and its cofactor dynactin from the plasma membrane to the minus ends of the MT which are close to the cell nucleus. The binding to the nuclear pores leads to a destabilization of the capsids, and the viral genome is released from the capsids into the nucleoplasm where it is transcribed and replicated by cellular and viral factors. The capsids are also transported along MTs of infected neurons after viral assembly but in this situation to the plus ends of MTs. They use probably the MT-motor kinesin which is responsable for the transport to the plus ends of MT in most cases. The MT mediated transport is not essential for virus cell entry in cultured cells, but without MTs the virus infection is severerly attenuated. So far, the viral receptors for the cellular MT-motors have not been characterized. Therefore, the role of several, non-essential tegument proteins for the MT-mediated transport were analyzed using different HSV1 mutants. To that end, the kinetic and MT-dependence of the early viral gene expression such as the early proteins ICP0 and ICP4 as well as the MT-dependence of the subcellular localisation of the incoming viral capsid were analyzed. HSV1 wildtype virus uses MTs for both, an efficient accumulation of capsids at the cell nucleus, and for the transport of the viral transcription factor VP16 that is localized in the tegument to the cell nucleus. Accordingly, early viral gene expression was much higher in the presence of MTs for all tested time points (2-7 h). First, a DUL46/47-mutant was analyzed that lacks the proteins VP11/12 and VP13/14. These proteins constitute with 15-18% a large portion of the tegument. In contrast to the other analyzed virus strains, the inoculum of that mutant contained much more ICP0, so ICP0-synthesis could not be analyzed by immunoblot. However, the synthesis of ICP4 was clearly time- and MT-dependent. Immunofluorescence microscopy experiments showed no capsid accumulation at the cell nucleus in contrast to wild-type virus. The subcellular localisation of the capsids was similar in the presence and absence of MTs. The low titer of the virus preparation, the high concentration of ICP0, and the ineffective capsid transport to the cell nucleus suggested that the DUL46/47-inoculum contained a large amount of non-infectious virus particles. Thus, either the DUL46/47-mutant fused only inefficiently with the plasma membrane, or the cytosolic capsids were no longer transported along MTs. The UL13 gene encodes a viral protein kinase that is localized in the tegument and could phosphorylate cellular or viral proteins after the viral cell entry. The DUL13-mutant used here lacks the amino acids that encode the kinase domain. The ICP0-expression was time- and MT-dependent but weaker than after wildtype infection. The incoming viral capsids accumulated at the cell nuleus, if the cells contained an intact MT network. The DUL13-capsids were transported by MT to the cell nucleus as is the case for wild-type virus. Thus, UL13 seems not to be necessary for capsid transport to the nucleus but it is required for efficient viral gene expression. The tegument protein US11 can interact with many RNA- and protein substrates. In this thesis an DUS11-mutant was analyzed, because it had been reported that US11 can bind to the MT-motor kinesin in vitro. The ICP0-synthesis of the DUS11-mutant showed no differences to wildtype virus; it was time- and MT-dependent. The incoming DUS11-capsids required MT for accumulation at the cell nucleus. The function of dynactin and dynein were inhibited by overexpressing the dynactin subunit dynamitin. Under this condition, wildtyp virus as well as the DUS11-mutant were transported to the plus ends of MTs in the cell periphery. Thus, US11 does neither seem to be involved in dynein-mediated capsid transport to the cell nucleus nor in transport to the MT plus ends in the cell periphery when the function of dynein had been inhibited. Thus, this transport to the cell periphery is either not mediated by kinesin, or HSV1 encodes another kinesin receptor besides US11. The results of these experiments suggest that the tegument proteins UL13 and US11 can be excluded as candidates for a viral dynein receptor. The tegument proteins VP11/12 (UL46) and VP13/14 (UL47) were either required for fusion of the viral envelope with the plasma membrane, or indeed for MT mediated capsid transport from the plasma membrane to the nucleus. Since the DUL46/47-deletion could effect the synthesis of the tegument structure during virus maturation, and in consequence also the incorporation of viral membrane proteins into the virus particle, an effect on virus entry can so far not be excluded. Thus, the membrane protein composition and virus fusion of the DUL46/47-mutant should be analyzed in further experiments to determine the reason for the early defects of a DUL46/47- virus infection. If capsids of the DUL46/47-mutant were released into the cytosol, a putative role of VP11/12 or VP13/14 in MT transport could be further analyzed using specific single deletion mutants. Moreover, additional mutants could be generated in which the capsids were also labelled with GFP to characterize the transport of the capsids along MT by video microscopy in living cells directly or in a biochemical in vitro assay.

Das Herpes-Simplex-Virus-Typ 1 (HSV1) ist das am besten charakterisierte Herpesvirus und gehört zu den humanpathogenen a-Herpesviren. a-Herpesviren verursachen zytolytische Infektionen in Epithelzellen der Schleimhäute und etablieren lebenslange latente Infektionen in sensorischen und autonomen Nervenganglien. Das latente Virus kann durch Stress zu einer lytischen Infektion reaktiviert werden und viele Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen. HSV1 tritt in Zellen ein, indem seine Membranhülle mit der Plasmamembran fusioniert. Dadurch werden das virale Kapsid und das Tegument, eine Proteinschicht zwischen Kapsid und Virushülle, in das Zytosol freigesetzt. Die Kapside werden entlang von Mikrotubuli (MT) durch den MT-Motor Dynein und seinen Kofaktor Dynactin von der Plasmamembran zum Minusende der MT, die in dichter Nachbarschaft des Zellkerns liegen, transportiert. Die Bindung an die Kernporen führt zu einer Destabilisierung der Kapside, und das virale Genom wird aus dem Kapsid in das Nukleoplasma freigesetzt, wo es von zellulären und viralen Faktoren transkribiert und repliziert wird. Während der Virusfreisetzung aus infizierten Neuronen werden Kapside auch entlang von MT transportiert, aber in diesem Fall zum Plusende der MT. Sie verwenden vermutlich den MT-Motor Kinesin, der in den meisten Fällen für den Transport zum Plusende der MT verantwortlich ist. Der MT-vermittelte Transport ist sowohl beim Zelleintritt als auch bei der Virusausschleusung von Zellkulturzellen nicht essentiell, aber ohne MT verläuft die Virusinfektion sehr viel milder. Die viralen Rezeptoren für die zellulären MT-Motoren sind bisher nicht charakterisiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Bedeutung einiger, nicht-essentieller Tegumentproteine für den MT-vermittelten Transport anhand von verschiedenen HSV1-Mutanten untersucht werden. Dazu wurden die Kinetik und MT-Abhängigkeit der frühen viralen Genexpression anhand der Proteine ICP0 und ICP4 sowie die MT-Abhängigkeit der subzellulären Lokalisation der eintretenden Viruskapside analysiert. HSV1-Wildtyp-Viren benötigten MT für eine effiziente Akkumulierung der Kapside am Zellkern sowie für den Transport des viralen Transkriptionsfaktors VP16, der auch im Tegument lokalisiert ist, zum Zellkern. Deshalb war auch die frühe virale Genexpression zu allen untersuchten Zeitpunkten von 2 bis zu 7 h Infektion MT-abhängig. Als erstes wurde eine DUL46/47-Mutante untersucht, der die Proteine VP11/12 und VP13/14 fehlen, die mit 15-18% einen großen Anteil des Teguments ausmachen. Das Inokulum dieser Mutante enthielt im Gegensatz zu den anderen untersuchten Virusstämmen soviel ICP0, so dass dessen Neusynthese nicht nachweisbar war. Dagegen war die Synthese von ICP4 eindeutig zeit- und MT-abhängig. Die immunfluoreszenzmikroskopischen Experimente zeigten im Gegensatz zu Wildtyp-Viren keine Akkumulierung der eintretenden Viruskapside am Zellkern. Die subzelluläre Lokalisation der Kapside war in An- und Abwesenheit der MT sehr ähnlich. Dies könnte entweder bedeuten, dass die DUL46/47-Mutante nur ineffektiv mit der Plasmamembran fusionierte oder dass die zytosolischen Kapside nicht mehr durch MT transportiert werden konnten. Der niedrige Titer, der hohe Gehalt an ICP0 sowie der ineffektive Kapsidtransport zum Zellkern deuten darauf hin, dass das DUL46/47-Inokulum einen überproportional hohen Anteil an nicht-infektiösen Viruspartikeln enthält. Das UL13-Gen kodiert für eine virale Proteinkinase, die im Tegument lokalisiert ist und somit Phosphorylierungsreaktionen nach dem viralen Zelleintritt katalysieren könnte. Der hier untersuchten DUL13-Mutante fehlen die Aminosäuren, die für die Kinase-Domäne kodieren. Die ICP0-Expression war Zeit- und MT-abhängig, aber schwächer als bei einer vergleichbaren Wildtyp-Infektion. Die eintretenden Viruskapside akkumulierten nach 3 h Infektion nur dann am Zellkern, wenn die Zellen ein intaktes MT-Netzwerk hatten. Die DUL13-Kapside wurden also wie beim Wildtyp durch MT zum Zellkern transportiert. Nach diesen Experimenten ist UL13 anscheinend nicht für den Kapsidtransport, aber für eine effektive virale Genexpression notwendig. Das Tegumentprotein US11 kann mit vielen RNA- und Proteinsubstraten interagieren. Da das US11 in vitro an den MT-Motor Kinesin bindet, wurde eine DUS11-Mutante untersucht. Die ICP0-Syntheserate der DUS11-Mutante zeigte keine Unterschiede zu Wildtyp-Viren; sie war zeit- und MT-abhängig. Die eintretenden DUS11-Kapside benötigten MT für eine effektive Akkumulierung am Zellkern. Durch die Überexpression einer Dynactin-Untereinheit, dem Dynamitin, kann die Funktion von Dynactin und Dynein in Zellen gehemmt werden. Aufgrund der Organsiation des MT-Netzwerkes muss dieser Transport von einem zum Plusende der MT gerichteten MT-Motor, wie zum Beispiel Kinesin katalysiert werden. Nach Dynamitin-Überexpression akkumulierten sowohl Wildtyp- als auch DUS11-Kapside im gleichen Maße in der Zellperipherie. US11 scheint somit weder beim Dynein-vermittelten Kapsidtransport zum Zellkern noch, wenn die Funktion von Dynein blockiert worden ist, beim Kapsidtransport zu den MT-Plusenden in die Zellperipherie eine Rolle zu spielen. Daraus folgt, dass dieser Transport in die Zellperipherie entweder nicht durch Kinesin vermittelt wird, oder das HSV1 neben US11 noch weitere Kinesin-Rezeptoren enthält. Aufgrund der hier durchgeführten Experimente können die Tegumentproteine UL13 und US11 als Kandidaten für einen viralen Dynein-Rezeptor ausgeschlossen werden. Die Tegumentproteine VP11/12 (UL46) und VP13/14 (UL47) könnten entweder für eine effektive Fusion zwischen Virushülle und Plasmamembran oder tatsächlich für den MT-vermittelten Transport durch das Zytoplasma benötigt werden. Eine Beteiligung der internen Tegumentproteine an der Membranfusion erscheint zunächst unwahrscheinlich. Aber durch die DUL46/47-Deletion könnte der Aufbau des Teguments während der Virusreifung und darauf folgend die Inkorporierung viraler Membranproteine in das Viruspartikel beeinträchtigt worden sein. Deshalb müßten in weiteren Experimenten die Membranproteinzusammensetzung sowie die Effizienz der Virusfusion der DUL46/47-Mutante untersucht werden, um zu bestimmen ob die DUL46/47-Kapside überhaupt in das Zytosol gelangen. Sollte dies der Fall sein, könnte eine mögliche Rolle von VP11/12 oder VP13/14 beim MT-Transport durch die Untersuchung spezifischer Einzelmutanten bestimmt werden. Desweiteren könnten Mutanten hergestellt werden, in denen die Kapside zusätzlich mit GFP markiert werden, um den Transport dieser Kapside entlang von MT direkt durch Videomikroskopie in lebenden Zellen oder in einem in vitro Versuchsansatz zu charakterisieren.

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Schmidt, Simone: Der Mikrotubuli-abhängige Transport verschiedener Tegumentprotein-Mutanten des Herpes-Simplex-Virus-Typ 1 von der Plasmamembran zum Zellkern. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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