Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur zytoplasmatischen Reifung von Eizellen des Rindes: Analyse der Regulation der Translation während der meiotischen Endreifung

Sterza, Fabiana

The technique of in vitro production of embryos was developed in the last two decades. However, although this technique is being used for breeding programs, it is still an object of research. The reasons therefore are the unsatisfactory yields of transferable embryos and their vitality as well.             From  results of available studies, it can be concluded that especially the processes of cytoplasmic maturation and the process of the coordination between nucleus and cytoplasmic maturation are under suboptimal conditions in vitro. The aim of the present study therefore was, to characterize cytoplasmic factors, which are important  for maturation and differentiation processes. With this intention, a contribution to the improvement of in vitro maturation systems should be performed. Previous studies showed that during meiotic maturation (transition from Prophase I/ GV-stadium to Metaphase II), the gene expression is regulated mainly at the level of translation. Therefore, we studied mechanisms involved in regulating the stimulation and repression of translation during this period. For this purpose, the activity of different protein kinases (cdc2, MEK, MAPK, Akt), the abundance of c-mos mRNA (c-Mos, a MAPKKK) and potentially substrates of these protein kinases, the regulators of translation eIF4E (cap-binding protein) and 4E-BP1 were analyzed. In general the translation can be controlled at different levels. The translation apparatus contains specific initiation factors. The effects of these factors are important for the binding of the small ribosomal subunit to the mRNA and their activity is mainly regulated by phosphorylation. The initiation factor eIF4E is termed to be the rate limiting factor of the cap-dependent translation. The investigation of translation rates during IVM showed a strong increase between GVBD and Metaphase I. In GV-stadium and Metaphase II only basal levels were observed. This increase correlated temporally with the phosphorylation of eIF4E, which continued until Metaphase II. In this stage the initiation factor eIF4E was completely phosphorylated. MAPK and cdc2K were activated at the same time parallel with eIF4E phosphorylation. The inhibition of cdc2K and indirectly of MAPK by Butyrolactone I (BLI) prevented GVBD and caused a complete and reversible inhibition of eIF4E phosphorylation. In contrast, the MAPK-pathway inhibition, by the MEK-Inhibitor, PD 098059 leads only to a postponed GVBD, and a delay in cdc2K and MAPK activity as well as of eIF4E phosphorylation. These results show that MAPK is involved in the phosphorylation of eIF4E and that cdc2K and MAPK activities are linked. Further experiments showed that de novo transcription of c-mos mRNA begun also at the time of GVBD together with cdc2K and MAPK activation. Therefore it is likely that active c-Mos Protein also appeared at this time, however no specific antibody was available for direct analysis. Since in Metaphase II only basal translation rates were observed, although eIF4E was completely phosphorylated, it was postulated that the effect of eIF4E should be repressed in the Metaphase II by other factors. Here it was demonstrated that a specific repressor of eIF4E activity (4E-BP1) exists in bovine oocytes. In metaphase II this factor was found mainly in its unphosphorylated form, that build a complex with eIF4E. This result showed that 4E-BP1 is involved in the repression of the translation at this stage of development. Furthermore, it was shown that 4E-BP1 phosphorylation correlates with Akt (PKB) activity during GVBD and Metaphase I. These results indicate that the regulation of the activity of factors like eIF4E and 4E-BP1, which limit translation rates, is not only regulated by the MAPK pathway but also by a signal transduction cascade that involves Akt.

In den zurückliegenden zwei Dekaden wurde das Verfahren der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen entwickelt. Obwohl die Produktionstechnik bereits für die Realisierung von Zuchtprogrammen genutzt wird, ist sie auch noch Gegenstand der Forschung. Grund dafür sind sowohl eine noch nicht ausreichend befriedigende Ausbeute an transfertauglichen Embryonen als auch deren Vitalität.             Aus vorliegenden wissenschaftlichen Ergebnissen auf diesem Gebiet, kann geschlussfolgert werden, dass insbesondere Prozesse der zytoplasmatischen Reifung von Eizellen bzw. Prozesse der Koordination von Kern- und Zytoplasmareifung unter In-vitro-Bedingungen suboptimal verlaufen. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, zytoplasmatische Faktoren zu charakterisieren, denen bei Reifungs- oder Differenzierungsprozessen eine wichtige Bedeutung zukommt. Damit soll ein Beitrag geleistet werden, längerfristig optimierte Reifungssysteme zu entwickeln, mit denen die Ausbeute an transfertauglichen Embryonen erhöht werden kann. Frühere Analysen zeigten, dass die Genexpression während der meiotischen Endreifung (Übergang von der Prophase I, GV-Stadium, zur Metaphase II) von Rindereizellen hauptsächlich auf Translationsebene kontrolliert wird. Deshalb wurden in der vorliegende Arbeit Mechanismen untersucht, welche die Stimulation und Reprimierung der Translation während der meiotischen Endreifung regulieren. Dazu wurde die Aktivität ausgewählter Proteinkinasen (cdc2K, MEK, MAPK, Akt), das Auftreten von c-mos mRNA (c-Mos, eine MAPKKK) und potentielle Substrate der genannten Proteinkinasen, die Regulatoren der Translation, eIF4E (cap-Bindungsprotein) bzw. 4E-BP1 analysiert. Generell kann die Translation auf mehreren Ebenen kontrolliert werden. Der Translationsapparat beinhaltet spezifische Initiationsfaktoren, deren Wirkung für die Bindung der ribosomalen Untereinheiten an die mRNA unabdingbar ist und deren Aktivität vorwiegend durch Phosphorylierung reguliert wird. In diesem Zusammenhang ist der Faktor eIF4E zu nennen, der als begrenzend für die Initiation der cap-abhängigen Translation angesehen wird. Die Analyse von Translationsraten während der IVM zeigt, dass ein starker Anstieg während des GVBD bis zum Erreichen der Metaphase I zu verzeichnen war. Im GV-Stadium, wie auch in der Metaphase II, traten hingegen nur basale Translationsraten auf. Dieser Anstieg korrelierte zeitlich mit der einsetzenden Phosphorylierung von eIF4E. Diese schritt bis zur Metaphase II fort, in welcher der Faktor vollständig phosphoryliert vorlag. Parallel dazu verlief auch die Aktivierung von cdc2K und MAPK. Die Inhibition der cdc2K und indirekt der MAPK durch Butyrolactone I führte zu einer Arretierung der Eizellen im GV-Stadium und zu einer vollständigen und reversibelen Inhibition der eIF4E-Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu führte eine Inhibition des MAP-Kinase-Weges durch den spezifischen MEK-Inhibitor PD 098059 nur zu einer Verzögerung des GVBD, der cdc2K- und MAPK-Aktivierung sowie der Phosphorylierung von eIF4E. Diese Ergebnisse zeigen, dass eIF4E über den MAP-Kinase-Weg phosphoryliert wird und dass eine Verbindung zwischen MAPK und cdc2K besteht. Weitere Untersuchungen ergaben, dass c-mos mRNAs mit einsetzendem GVBD und beginnender Aktivierung von cdc2K und MAPK De novo transkribiert wurden. Man muss davon ausgehen, dass das c-Mos Protein in Rindereizellen zu diesem Zeitpunkt auch in aktiver Form auftritt, obwohl für einen direkten Nachweis keine spezifischen Antikörper zu Verfügung standen. Die Tatsache, dass in der Metaphase II nur basale Translationsraten auftraten, obwohl eIF4E vollständig phosphoryliert ist, führte zu der Vermutung, dass die Wirkung von eIF4E in der Metaphase II durch zusätzliche Faktoren reprimiert wird. In Rindereizellen konnte ein spezifischer Repressor von eIF4E, das Bindungsprotein 4E-BP1 nachgewiesen werden. Dieses Bindungsprotein lag in der Metaphase II zu einem Teil in unphosphorylierter Form vor. Es bildete mit eIF4E einen Komplex und war somit maßgeblich an der Repression der Translation zu diesen Zeitpunkt beteiligt. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von 4E-BP1 während des GVBD und der Metaphase I mit der Aktivierung von Akt (PKB) korreliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivität von Faktoren (eIF4E, 4E-BP1), welche Translationsraten begrenzen, nicht nur über den MAP-Kinase-Weg, sondern auch gegenläufig über eine Signalkaskade, die Akt beinhaltet, reguliert werden.

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Sterza, Fabiana: Untersuchungen zur zytoplasmatischen Reifung von Eizellen des Rindes: Analyse der Regulation der Translation während der meiotischen Endreifung. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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