Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Funktion der Motorproteine Dynein und Kinesin in der Reifung und Sekretion von Zymogengranula des exokrinen Pankreas der Ratte

Weber, Ina-Alexandra

The directed and controlled secretion of digestive enzymes in acinar cells of the exocrine pancreas requires a defined and controlled transport of zymogen granules by motor proteins and cytoskeleton elements. In the pathogenesis of an acute pancreatitis these mechanisms are disturbed. Secretion is blocked, the cytoskeleton degraded and pancreatic proteases are premature activated in autophagic vacuoles. The factors triggering this process and the involvement of motor proteins are yet unknown. The animal model of a supramaximal secretagogue stimulation in rats induces an acute pancreatitis by infusion of the secretagogue cerulein at excess concentrations. Using this animal model the function of the microtubuli binding motor proteins dynein and kinesin in resting pancreas acinar cells and physiologically or supramaximal stimulated cells was investigated. Dynein and Kinesin mediate the transport of secretory proteins and cell organelles in eucaryotic cells. In unstimulated healthy pancreas acinar cells dynein and kinesin were completely localized in the Trans-Golgi-Network (TGN) area. Both motor proteins colocalized with specific golgi marker proteins and tubulin, but were distinct of actin microfilaments. Immunogold staining detected by electron microscopy revealed a localization on the surface of golgi vesicles. No dynein and kinesin staining was found on the surface of zymogen granules and at the apical membrane, where exocytosis takes place. The method of a temperature dependent microtubule polymerisation demonstrated the association of kinesin with microtubules upon physiological cerulein stimulation. In parallel the golgi complex was expanded at a time point where exocytosis of zymogen granules was nearly completed. Physiological cerulein stimulation did not induce a relocalization of the motor proteins dynein and kinesin to zymogen granules, the proteins still colocalized with golgi vesicles. Dynein and kinesin are known golgi vesicle motors and bind golgi vacuoles to microtubules. These results suggest a new concept for the development and maturation of pancreatic secretory vesicles: In contrast to the so far assumed budding of premature granules from the TGN, followed by a motor protein mediated transport to the apical cell region, the new concept describes a expansion of the TGN upon zymogen granule exocytosis to the apical cell pole. Here, TGN vesicles can dissociate and develop to condensing vacuoles and premature zymogen granules. With the maturation and condensation the golgi markers disappear from the granules and the TGN is retracted to the perinuclear region. The continuous expression of dynein, kinesin and tubulin upon supramaximal secretagogue stimulation showed, that the cytoskeleton disassembly was not a result of a proteolytic degradation of cytoskeleton elements. During acute pancreatitis dynein and kinesin were still localized at a perinuclear cell compartment. In conclusion this demonstrates that the disassembly of microtubules in the beginning of an acute pancreatitis is a regulated process and that the motor proteins dynein and kinesin have no function in the blockage of zymogen granule exocytosis. The golgi complex disintegrated in the beginning of an acute pancreatitis to small vesicles distributed to all cytosolic compartments of acinar cells. Immunoprecipitation studies revealed a fast Tyrosine-phosphorylation of dynein and kinesin in the beginning of an acute pancreatitis. Phosphorylation inhibits the cargo binding or the movement of motor proteins in various cellular systems. Tyrosine-phosphorylation of dynein and kinesin indicates a rapid inactivation in an acute pancreatitis and may contribute to the disintegration of the golgi complex and vesicle fusion resulting in large vacuoles.

Die gerichtete und kontrollierte Sekretion von Verdauungsenzymen in den Azinuszellen des exokrinen Pankreas erfordert einen definierten und kontrollierten Transport von Zymogengranula durch Motorproteine und Zytoskelett-Bestandteile. In der Pathogenese der akuten Pankreatitis bricht dieser Mechanismus zusammen. Es kommt zu einer Blockade der Sekretion, dem Zerfall des Zytoskeletts und der vorzeitigen intrazellulären Aktivierung der Verdauungsproteasen in sogenannten autophagischen Vakuolen. Welche Faktoren diesen Prozess auslösen, und ob Motorproteine daran beteiligt sind, ist nicht bekannt. Im Tiermodell der supramaximalen Sekretagog-Stimulation in Ratten wird eine akute Pankreatitis durch Infusion unphysiologisch hoher Konzentrationen des Sekretagogs Cerulein ausgelöst. In diesem Tiermodell wurde die Funktion der Mikrotubuli-bindenden Motorproteine Dynein und Kinesin im Ruhezustand der Pankreas-Azinuszellen, nach physiologischer und nach supramaximaler Cerulein-Stimulation untersucht. Dynein und Kinesin sind in eukaryontischen Zellen am Transport sekretorischer Proteine und von Zellorganellen beteiligt. Dynein und Kinesin waren in unstimulierten gesunden Pankreas-Azinuszellen vollständig im Bereich des Trans-Golgi-Network (TGN) lokalisiert. Beide Motorproteine kolokalisierten mit spezifischen Golgi-Markern und dem Zytoskelettprotein Tubulin, nicht aber mit Aktin-Mikrofilamenten. Nach Immunogold-Markierung waren Dynein und Kinesin durch Elektronenmikroskopie an der Membran von Golgi-Vesikeln nachweisbar. Am apikalen Zellpol, an dem die Exozytose der Verdauungsenzyme erfolgt und an der Oberfläche von Zymogengranula, waren Dynein und Kinesin nicht markiert. Eine Funktion in der Regulation der Fusion, der Fission oder der Exozytose von Zymogengranula ist daher unwahrscheinlich. Mit der Methode der Temperatur-abhängigen Mikrotubuli Polymerisation wurde nachgewiesen, dass die physiologische Sekretagog-Stimulation die Assoziation von Kinesin an Mikrotubuli induziert. Dies geschieht zeitgleich mit einer Ausdehnung des Golgi-Komplexes zu einem Zeitpunkt, zu dem die Exozytose der Zymogengranula gerade erfolgt ist. Die Motorproteine Dynein und Kinesin waren auch nach physiologischer Stimulation nicht mit verbliebenen Zymogengranula sondern nur mit dem TGN kolokalisiert. Dynein und Kinesin können die Vesikel des TGN bewegen und sind an seiner Verankerung an Mikrotubuli beteiligt. Diese Ergebnisse legen ein neues Konzept für die Entstehung und Reifung sekretorischer Vesikel im Pankreas nahe: Statt der bisher angenommenen Abschnürung unreifer Granula vom TGN, die anschließend entlang von Motorproteinen zum apikalen Zellpol transportiert werden, würde es nach diesem neuen Modell nach Exozytose der gereiften Zymogengranula zu einer Ausdehnung des TGN bis zum apikalen Pol der Zelle kommen, aus dem sich dann sekretorische TGN Vesikel abschnüren, bevor sie zu kondensierenden Vakuolen und Zymogengranula ausreifen. Mit der Reifung und Kondensierung des sekretorischen Inhalts verlieren sie ihre Golgi-Marker und das TGN bildet sich wieder zurück. Die gleichbleibende Expression von Dynein, Kinesin und Tubulin nach supramaximaler Sekretagog-Stimulation zeigt, dass das Zytoskelett nicht durch proteolytische Degradation seiner Bestandteile zerfällt. Die Motorproteine blieben auch unter diesen Bedingungen perinukleär lokalisiert. Damit war gezeigt, dass der Zerfall der Mikrotubuli ein regulierter Prozess ist und dass weder Dynein noch Kinesin an der Blockade der Exozytose beteiligt sind. Mit dem Beginn einer akuten Pankreatitis zerfiel auch der Golgi-Komplex in kleine Vakuolen, die sich über die gesamte Azinuszelle verteilten. In Immunpräzipitationsversuchen unmittelbar nach Beginn der supramaximalen Stimulation waren Dynein und Kinesin an Tyrosin-Resten phosphoryliert. Über die Phosphorylierung von Dynein und Kinesin kann die Bindung an die Last oder die Bewegung der Motorproteine negativ reguliert werden. Dies legt eine rasche Inaktivierung der Motorproteine zu Beginn der Pankreatitis nahe und könnte zum beobachteten Zerfall des TGN und zur Verschmelzung von Vesikeln zu größeren Vakuolen beitragen.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Weber, Ina-Alexandra: Die Funktion der Motorproteine Dynein und Kinesin in der Reifung und Sekretion von Zymogengranula des exokrinen Pankreas der Ratte. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export