Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The novel CLCA gene family of multifunctional calcium-activated chloride channels

Leverköhne, Ina

The CLCA gene family of putative Ca2+-activated Cl- channels has been discovered approximately ten years ago. CLCA genes appear to represent a distinct family that bears little or no resemblance to any other genes known. To date, eleven family members have been identified in mammals, including the human and the murine species. Mounting evidence suggests that the CLCA gene family comprises a functionally complex group of transmembrane proteins which are involved in biologically important pathways in both epithelial and endothelial microenvironments, namely in ion conductivity, in cell-cell adhesion and in apoptosis. In addition, several reports propose a role for CLCA homologs in diseased tissues as well.   The present study was based on the working hypothesis that CLCA proteins are involved in transmembraneous anion currents. It was designed to provide a better understanding of these novel putative channel proteins in the mouse. To address this challenge, mainly functional genomics were performed. On the one hand, genetic assays were designed to precisely map murine CLCA genes to the mouse genome and to differentiate between closely related murine CLCA genes. On the other hand, protein assays were designed to characterize the protein processing and the transmembrane structure of the third murine homolog, mCLCA3, in vitro and ex vivo and to establish its precise tissue, cellular and intracellular protein distribution pattern in normal murine tissues.   The following results were obtained: First, chromosomal mapping of the murine mCLCA1 and mCLCA3 genes based on radiation hybrid panel screening revealed tight genomic clustering of the two genes on mouse chromosome 3 band H2-H3. Of note, the human CLCA genes are similarly clustered on the syntenic locus on the short arm of human chromosome 1. Second, genomic Southern blot hybridizations suggested the existence of two separate yet extremely closely related murine genes encoding mCLCA1 and mCLCA2. Third, in vitro and ex vivo immunoblot analyses performed of both the recombinant mCLCA3 polypeptide and the native protein established mCLCA3 as a membrane-spanning protein with a large hydrophilic amino terminus. This is similar to the structures of other CLCA homologs. Further similarities were the sizes of the primary translation product with approximately 100 kDa and the glycosylated product with approximately 110 kDa, a post-translational proteolytic cleavage event resulting in an approximately 90-kDa amino-terminal cleavage product and the size of a hydrophilic amino terminus of approximately 35 kDa. Fourth, comprehensive light-, confocal laser scanning- and transmission electron microscopical immunolocalization analyses revealed that the mCLCA3 protein is intimately associated with the mucin granule membranes of respiratory, intestinal and uterine goblet cells.   Clustering of partly very closely, partly less closely related murine and human CLCA genes on syntenic loci underlines their origin from a distant common ancestor and is consistent with relatively late evolutionary branching events of select CLCA genes. This was also confirmed by the differentiation of distinct mCLCA1 and mCLCA2 genes, yet sharing a very high degree of homology (96 % cDNA identity). The close relationship among the murine genes encoding mCLCA1, mCLCA2 and mCLCA4 has to be kept in mind for the interpretation of previous and future experiments.   The analyses of the mCLCA3 protein processing and transmembrane structure are consistent with a role for mCLCA3 in ion conductivity as proposed as working hypothesis for the present study. The localization of the mCLCA3 protein to membranes of goblet cell mucin granules is suggestive of a function in the synthesis, condensation or secretion of mucins. These data complement previous reports in which a significant regulatory role for mCLCA3 in mucin secretion in murine models of asthma and cystic fibrosis was postulated. These disorders are associated with severe mucus accumulation and changes in the mucin composition. The novel hypothesis, as derived from the present study, that mCLCA3 participates in the process of mucin production will have to be tested in the future by functional experiments in addition to the morphological and structural analyses performed in the present study.

Die CLCA-Genfamilie mutmaßlicher Ca2+-aktivierter Cl--Kanäle ist vor etwa zehn Jahren entdeckt worden. CLCA-Gene scheinen eine eigene Familie zu repräsentieren, die wenig oder keine Ähnlichkeiten zu anderen bekannten Genen aufweist. Bislang sind elf Familienmitglieder bei Säugetieren einschließlich des Menschen und der Maus beschrieben worden. Bisherige Arbeiten weisen zunehmend darauf hin, dass die CLCA-Genfamilie eine funktionell komplexe Gruppe von Transmembranproteinen umfasst, welche an wichtigen biologischen Abläufen sowohl in epithelialen als auch endothelialen Geweben beteiligt sind, nämlich an Ionenleitfähigkeiten, Zell-Zell-Adhäsionsprozessen und Apoptose. Zusätzlich wird in mehreren Veröffentlichungen eine Rolle für CLCA-Homologe bei verschiedenen Krankheiten postuliert.   Die vorliegende Studie basierte auf der Arbeitshypothese, dass CLCA-Proteine am transmembranösen Anionentransport beteiligt sind. Sie wurde mit dem Ziel konzipiert, ein besseres Verständnis dieser neuen mutmaßlichen Kanalproteine bei der Maus zu erlangen. Dazu wurden vorrangig funktionelle Genstudien durchgeführt. Einerseits wurden Untersuchungen zur genauen Ermittlung des chromosomalen Genortes muriner CLCA-Gene sowie zur Unterscheidung von eng verwandten murinen CLCA-Genen durchgeführt. Andererseits wurden Proteinanalysen sowohl zur Charakterisierung der Reifung und der Transmembranstruktur des dritten murinen CLCA-Proteins, mCLCA3, in vitro und ex vivo als auch zur genauen Ermittlung seines Verteilungsmusters im gesunden Gewebe, auf Zellebene und in der Zelle selbst durchgeführt.   Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Die Bestimmung der chromosomalen Genorte für die murinen mCLCA1- und mCLCA3-Gene, basierend auf der "radiation hybrid panel screening“-Methode, deckte eine enge genomische Gruppierung der beiden Gene auf dem Chromosom 3 Bande H2-H3 der Maus auf. Eine ähnliche Gruppierung liegt interessanterweise für die menschlichen CLCA-Gene am syntenischen Genort auf dem kurzen Arm des Chromosoms 1 des Menschen vor. Die Hybridisierungen genomischer DNA-blots ließen auf die Existenz zweier separater, jedoch sehr eng verwandter muriner Gene schließen, welche mCLCA1 und mCLCA2 kodieren. Mittels in vitro und ex vivo Immunoblot-Analysen wurde festgestellt, dass sowohl das rekombinante mCLCA3-Polypeptid als auch das native mCLCA3-Protein ein Transmembranprotein mit einem großen, hydrophilen Aminoterminus bilden. Dieses stimmt mit früheren Arbeiten zu anderen CLCA-Homologen überein. Weitere Übereinstimmungen wurden in den Größen des primären Translationsproduktes von etwa 100 kDa und des glykosylierten Produktes von etwa 110 kDa gefunden, in der posttranslationalen proteolytischen Spaltung mit einem resultierenden amino-terminalen Spaltprodukt von etwa 90 kDa und in dem hydrophilen Aminoterminus von etwa 35 kDa. Umfassende licht-, konfokale Laser scanning- und transmissionselektronen-mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das mCLCA3-Protein eng mit den Membranen der Muzingranula respiratorischer, intestinaler und uteriner Becherzellen assoziiert ist.   Die Gruppierung teils sehr eng, teils weniger eng verwandter muriner und menschlicher CLCA-Gene auf syntenischen Genorten unterstreicht ihren Ursprung von einem früheren gemeinsamen Vorläufer und spricht für die evolutionär relativ späte Entstehung einzelner CLCA-Gene. Dieses wird auch durch die Unterscheidung separater Gene für mCLCA1 und mCLCA2 bestätigt, welche eine sehr hohe Homologie aufweisen (96 % identisch auf cDNA-Ebene). Die enge Verwandtschaft der murinen mCLCA1-, mCLCA2- und mCLCA4-Gene muss bei der Interpretation früherer und zukünftiger Untersuchungen berücksichtigt werden.   Die Untersuchungen zur Reifung und Transmembranstruktur des mCLCA3-Proteins sind vereinbar mit der als Arbeitshypothese postulierten Rolle im Rahmen von Ionenleitfähigkeiten. Die ultrastrukturelle Lokalisierung des mCLCA3-Proteins, nämlich seine enge Assoziation mit den Membranen der Becherzell-Muzingranula, spricht für eine Funktion des Proteins im Rahmen der Synthese, Verdichtung oder Sekretion von Muzinen. Diese Daten komplementieren bereits publizierte Ergebnisse, nach denen mCLCA3 eine signifikante regulatorische Funktion im Rahmen der Muzinsekretion in murinen Modellen für Asthma und Zystische Fibrose einnimmt. Diese Krankheiten gehen mit hochgradiger Schleimansammlung sowie Veränderungen der Schleimzusammensetzung einher. Die sich aus der vorliegenden Arbeit neu ergebende Hypothese, dass mCLCA3 am Prozess der Mukusproduktion beteiligt ist, muss über die hier durchgeführten morphologischen und strukturellen Untersuchungen hinaus zukünftig durch funktionelle Studien erhärtet werden.

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Leverköhne, Ina: The novel CLCA gene family of multifunctional calcium-activated chloride channels. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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