Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss von Blutplasma auf die Prostaglandinsynthese und die Proliferation von caninen Kerationzyten

Hasseler, Marion Edith

As demonstrated in preliminary tests, the addition of blood plasma to cultured canine keratinocytes induces an increased proliferation and an enhanced release of PGE2. These effects were independent of age, race and sex of the dogs that provided the blood. In the present study was examined, what kind of influence plasma exhibits on in vitro cultured canine keratinocytes. Furthermore it was explored, which plasma fraction is responsible for the observed effects. A possible interaction between keratinocytes and fibroblasts was also taken into account. Finally, the influence of pharmacological active substances (flunixin, DFU and dexamethasone) on the described findings was studied. The parameters determined in these examinations included the concentration of PGE2 in cell culture supernatant of keratinocytes, the regulation of proinflammatory enzymes and the influence on cell proliferation. Plasma induces both proliferation and PGE2 release of cultured canine keratinocytes. After plasma was splitted into different fractions, these single fractions were also added to the cells. It was observed, that fraction 3 (10 - 30 kDa) exhibits an exclusive proliferative effect, while fraction 5 (> 50 kDa) additionaly induces the PGE2 synthesis of the cells. The fractions 1 (< 5 kDa), 2 (5 - 10 kDa) and 4 (30 - 50 kDa) did not affect the keratinocytes. Fraction 3 consits mostly of growth factors like KGF and PDGF, that are described as both directly and indirectly effecting the proliferation of keratinocytes. The indirect proliferative effect is mediated via PGE2, wherefore it can be excluded, since fraction 3 did not influence the PGE2 synthesis of the keratinocytes. Furthermore, direct addition of PGE2 itself to cultured canine keratinocytes did not result in an enhanced proliferation. Orientating tests using components of fraction 5 revealed that the herein included immunoglobulins play a pivotal role concerning the observed effects. These results give a hint regarding the involvement in inflammatory reactions and wound healing. Examinations with cultured canine keratinocytes and fibroblasts demonstrated, that the fibroblasts exhibit no influence on the proliferation of keratinocytes, regardless of plasma addition. On the other hand, PGE2 release by keratinocytes was increased by the participation of fibroblasts and plasma addition. Without plasma addition comparable results were not achieved. Addition of the non specific COX inhibitor flunixin (0.3 µmol/ml) and the selective COX-2 inhibitor DFU (10 µmol/ml) resulted both in a distinct reduction of the plasma-induced PGE2 synthesis in cultured canine keratinocytes. In contrast, dexamethasone only slightly reduced the PGE2 concentration in the cell culture supernatant. None of the substances showed an effect on the enhanced proliferation activity. These results indicate, that plasma-induced PGE2 synthesis and enhancement of proliferation of cultured canine keratinocytes are caused by different mechanisms. Both reactions may be induced by the same plasma component, but therefore one does not need to be connected with the other. In conclusion, in the described model, the proliferation of cultured canine keratinocytes can not be attributed to an effect of PGE2.

In Vorversuchen wurde festgestellt, dass die alleinige Zugabe von Blutplasma zu caninen Keratinozyten, unabhängig von Alter, Rasse und Geschlecht der Hunden, denen das Blut entnommen wurde, zu einer Erhöhung der PGE2-Freisetzung und Proliferation der Zellen führt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss Plasma auf die in vitro angezüchteten caninen Keratinozyten hat. Außerdem wurde geprüft, welche Plasmafraktion für die zu beobachtenden Effekte verantwortlich ist. Mögliche Interaktionen zwischen Keratinozyten und Fibroblasten wurden berücksichtigt. Abschließend wurde geprüft, ob und in welcher Form pharmakologisch wirksame Substanzen (Flunixin, DFU und Dexamethason) gefundene Effekte beeinflussen können. Als Parameter dienten die Prostaglandin-Konzentration in Zellkulturüberständen der Keratinozyten, die Regulation proinflammatorischer Enzyme und die Beeinflussung der Zellproliferation. Plasma induziert die Proliferation und PGE2-Produktion von caninen Keratinozyten. Nach Aufspaltung des Plasmas in verschiedene Fraktionen wurden die einzelnen Plasmafraktionen zu den caninen Keratinozyten gegeben. Hieraus ergab sich, dass die Fraktion 3 (10-30 kDa) einen ausschließlich proliferativen Effekt auf die Keratinozyten auslöste, während Fraktion 5 (> 50 kDa) neben einer Proliferationssteigerung zusätzlich die PGE2-Synthese der Zellen anregte. Die Fraktionen 1 (< 5 kDa), 2 (5-10 kDa) und 4 (30-50 kDa) hatten keine Auswirkungen auf die Keratinozyten. Fraktion 3 enthält in erster Linie Wachstumsfaktoren, wie z.B. KGF und PDGF, denen sowohl ein direkt proliferativer Effekt auf Keratinozyten zugeschrieben wird, als auch ein indirekt proliferativer Effekt, bei dem die Proliferation über PGE2 katalysiert wird. Dieser indirekt proliferative Effekt wird hier zum einen dadurch ausgeschlossen, dass Fraktion 3 keinen Effekt auf die PGE2-Synthese der Keratinozyten hatte und zum anderen dadurch, dass die direkte Zugabe von PGE2 zu caninen Keratinozyten nicht zu einer gesteigerten Proliferation der Zellen führte. Auf die Komponenten der Fraktion 5 wurde durch erste orientierende Versuche ansatzweise eingegangen. Hierbei konnte festgestellt werden, dass vermutlich die in der Fraktion 5 beinhalteten Immunglobuline eine wichtige Rolle bezüglich der beobachteten Effekte spielen, was einen Hinweis auf eine Beteiligung im Entzündungsgeschehen und der Wundheilung gibt. In Untersuchungen an caninen Keratinozyten und Fibroblasten zeigte sich, dass die Proliferation der Keratinozyten durch Beteiligung der Fibroblasten mit und ohne Zugabe von Plasma nicht beeinflusst werden konnte, während die PGE2-Freisetzung der Keratinozyten unter Beteiligung von Fibroblasten mit Plasmazusatz deutlich anstieg, nicht jedoch bei der Gruppe ohne Plasmazusatz. Die Zugabe von Flunixin (0,3 µmol/l) als unspezifischer Cyclooxygenase-Inhibitor, DFU (10 µmol/l) als spezifischer COX-2-Inhibitor und Dexamethason (0,1 µmol/l) als steroidales Antiphlogistikum, führte bei Flunixin und DFU zu einer deutlichen, bei Dexamethason nur zu einer geringen Hemmung der plasmabedingten PGE2-Induktion bei caninen Keratinozyten. Keine der Substanzen konnte jedoch die durch Plasma gesteigerte Proliferation beeinflussen. Durch die Versuchsergebnisse wird die Annahme bestärkt, dass der plasmabedingten Induktion der PGE2-Synthese und der Steigerung der Proliferation von caninen Keratinozyten zwei unterschiedliche Mechanismen zugrundeliegen, die beide zwar möglicherweise durch die selbe Plasmakomponente ausgelöst werden, miteinander jedoch in keiner direkten Verbindung stehen. Die Proliferation der caninen Keratinozyten kann in dem hier eingesetzten Versuchsmodell also nicht auf die Wirkung von PGE2  zurückgeführt werden.

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Hasseler, Marion Edith: Untersuchungen zum Einfluss von Blutplasma auf die Prostaglandinsynthese und die Proliferation von caninen Kerationzyten. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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