Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Vorkommen östrogenartig wirkender Substanzen in Tränkwasser, Futtermitteln und Stallstaub mit Hilfe eines Reportergenverfahrens

Kluczka, Tatjana

Fertility disorders are causing economical losses in animal production. In a number of cases of hyperestrogenism - a major problem in swine production - contamination of feedstuffs with the mycotoxin zearalenone could be found. Involvement of other estrogenically active substances as a cause of hyperestrogenism cannot be excluded. Therefore the presented study was aimed to find an assay with which, without performing labour-intensive single component analyses, it is possible to examine water, feed and stable dust for their estrogenic activity. Hereby the objective of the study was to determine the total estrogenic activity of a sample, therefore also taking into consideration unknown substances. Established procedures of estrogenic activity are in vitro bioassays,  in particular reportergene-assays. Various transiently and stably transfected cell lines were tested for their suitability. Out of the tested cell lines HEK ER 293 alpha and beta showed the best sensitivity and inducibility. Transiently transfected MCF-7 and HeLa cells as well as the stably transfected MVLN and H-Gal hER alpha and beta cells showed only week inducibility and sensitivity 1000-fold less than that of HEK 293 alpha and beta cells. Extraction of water samples was performed using a solid-phase-extraction procedure, possessing a limit of detection of 0,08 pM 17b-Estradiol in alpha cells and 0,3 pM 17b-Estradiol in beta cells. Recovery was between 68 and 106 % for 17b-Estradiol, Bisphenol A and Butylbenzylphthalate. Feed and dust samples were extracted using a liquid-liquid-extraction technique. Mean recovery for 17b-Estradiol was 79,8 % and for Genistein and Zearalenone  81,6 %. Limits of detection were below 50 ng 17b-Estradiol / kg for alpha and below 300 ng 17b-Estradiol / kg for beta receptor cells. With the combination of extraction procedure and reportergene-assay samples could be reproducibly screened for estrogenic activity. Furthermore estrogenic activities of examined samples were quantitatively determined as Estradiol-Equivalents. Due to variation of the cell culture mean standard deviation was 35 %. The established procedure was tested in a number of samples originating from a swine farm severely affected with hyperestrogenism. Drinking water did not show elevated estrogenic activity. Feed samples in contrast showed high estrogenic activity with 0,5 – 1,1 µg alpha-active and 28 – 131 µg beta-active Estradiol-Equivalents / kg as well as dust samples with 2 – 226 µg alpha-active and 4 – 140 µg beta-active Estradiol-Equivalents / kg. Mean contents of Estradiol-Equivalents in feed from farms with hyperestrogenism was 3,3 µg alpha-active and 126 µg beta-active Estradiol-Equivalents / kg and therefore twice as high as in feed samples of farms without hyperestrogenism with levels of 1,2 µg alpha-active and 78 µg beta-active Estradiol-Equivalents / kg, however, variation of the examined feedstuffs was high, therefore not possessing statistic significance. Contribution of zearalenone to total estrogenic activity of feed samples was low. Various feedstuff components showed a wide range of contents of Estradiol-Equivalents and showed the following ranking: soy > rape > corn > oat > rye > barley. Varying contents of Estradiol-Equivalents were observed in various groups of components as well as within the groups. Further examinations are required to examine a statistically significant correlation between total estrogenic activity of feedstuffs and the occurrence of hyperestrogenism.

Fruchtbarkeitsstörungen verursachen wirtschaftliche Schäden in der Nutztierhaltung. Bei dem in der Ferkelproduktion eine wichtige Rolle spielenden Problem des Hyperöstrogenismus kann in einem Teil der Fälle eine Kontamination der Futtermittel mit dem Mykotoxin Zearalenon nachgewiesen werden. Da eine Beteiligung weiterer östrogen aktiver Substanzen bei der Verursachung von Hyperöstrogenismus nicht auszuschließen ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nach einem Untersuchungsverfahren gesucht, mit dem, ohne aufwändige Einzelstoffanalysen zu betreiben, Tränkwasser-, Futtermittel- und Staubproben auf deren östrogene Aktivität untersucht werden können. Dabei war das Ziel, die östrogene Gesamtaktivität einer Probe zu erfassen, so dass dabei auch unbekannte östrogen aktive Komponenten berücksichtigt werden. Etablierte Verfahren zur Erfassung östrogener Aktivität sind in vitro Bioassays, insbesondere Reportergenassays. Verschiedene transient transfizierte sowie stabil transfizierte Zelllinien wurden auf ihre Eignung überprüft. Von den getesteten Zelllinien wiesen HEK 293 ER alpha und beta Zellen die größte Sensitivität und Induzierbarkeit auf. Transient transfizierte MCF-7 und HeLa – Zellen sowie die stabil transfizierten MVLN und H-Gal hER alpha und beta Zellen zeigten nur eine schwache Induzierbarkeit sowie eine um bis zu 1000-fach geringere Sensitivität als die HEK 293 ER alpha und beta Zellen. Für die Extraktion der Wasserproben wurde eine Festphasenextraktion eingesetzt, mit der eine Nachweisgrenze von 0,08 pM 17b-Estradiol im alpha-Rezeptortest und 0,3 pM 17b-Estradiol im beta-Rezeptortest erreicht wurde. Die Wiederfindungsraten für 17b-Estradiol, Bisphenol A, Butylbenzylphthalat lagen zwischen 68 und 106 %. Futter- und Staubproben wurden mit einem Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren extrahiert. Die mittlere Wiederfindungsrate lag für 17b-Estradiol bei 79,8 % und für Genistein und Zearalenon bei 81,6%. Nachweisgrenzen für das Extraktionsverfahren für Futter und Staub lagen bei unter 50 ng 17b-Estradiol / kg für den alpha-Rezeptortest und bei unter 300 ng 17b-Estradiol / kg für den beta-Rezeptortest. Mit dem kombinierten Verfahren aus Extraktion und Reportergenassay konnten die Proben reproduzierbar auf deren östrogene Aktivität gescreent werden. Weiterhin konnte die östrogene Aktivität der untersuchten Proben quantitativ als Estradiol-Equivalente bestimmt werden. Dabei ergab sich bedingt durch die Variation in der Zellkultur eine durchschnittliche Standardabweichung von 35 %. Das entwickelte Verfahren wurde für eine Reihe von Proben aus einem Problembetrieb eingesetzt. In Tränkwasser konnte keine erhöhte östrogene Aktivität gemessen werden. Dagegen wurden in Futterproben des beprobten Hofes Gehalte von 0,5 – 1,1 µg alpha-aktiven und 28 – 131 µg beta-aktiven Estradiol-Equivalenten / kg sowie in Staubproben Gehalte von 2 – 226 µg alpha-aktiven und 4 – 140 µg beta-aktiven Estradiol-Equivalenten / kg gemessen. Der mittlere Gehalt von Estradiol-Equivalenten in Futtermitteln aus Betrieben mit Hyperöstrogenismus lag mit 3,3 µg alpha-aktiven und 126 µg beta-aktiven Estradiol-Equivalenten / kg doppelt so hoch wie die 1,2 µg alpha-aktiven und 78 µg beta-aktiven Estradiol-Equivalente / kg in Futtermitteln aus Betrieben ohne Hyperöstrogenismus, allerdings war die Streuung der untersuchten Futtermittel sehr hoch, so dass noch keine statistische Signifikanz besteht. Der Beitrag von Zearalenonkontaminationen zur östrogenen Gesamtaktivität von Futtermittelproben erwies sich als gering. In verschiedenen Futtermittelkompenenten konnten sehr unterschiedliche Gehalte an Estradiol-Equivalenten gemessen werden. Dabei ergab sich folgende Reihung im Gehalt an Estradiol-Equivalenten: Soja > Raps > Mais > Hafer > Weizen > Roggen > Gerste. Unterschiedliche Gehalte ergaben sich sowohl zwischen den einzelnen Gruppen von Futtermittelkomponenten als auch innerhalb der einzelnen Gruppen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um einen statistisch abgesicherten Zusammenhang zwischen dem Gesamtgehalt an östrogener Aktivität von Futtermitteln und dem Auftreten von Hyperöstrogenismus zu untersuchen.

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Kluczka, Tatjana: Untersuchungen zum Vorkommen östrogenartig wirkender Substanzen in Tränkwasser, Futtermitteln und Stallstaub mit Hilfe eines Reportergenverfahrens. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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