Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Resorption von ätherischen Ölen über die Zitzenschleimhaut am isoliert perfundierten Rindereuter

Maurer, Kathrin

The aim of the presented study was to examine the absorption of intracisternally administered substances at the isolated perfused bovine udder. The used substance Myrtol standardized is the active principle of a human pharmaceutical specialty, which is taken as a gastric-fluid-resistent capsule and is mainly absorbed in the small intestines. A method for determination of the three main compounds α-pinene, R-limonene and 1,8-cineole should have been developed additionally. There are literature data which show that the three compounds of Myrtol standardized are detectable in human plasma only in nanogramme-like concentrations. Requirement for the determination of the single compounds of Myrtol standardized in the perfusate of the isolated perfused bovine udder was therefore a selective analytical method with a low limit of quantitation. By using gas chromatography with mass selective detection in a PCI-mode 2,0 ng/ml was reached as the limit of quantitation. The pre-study validation performed by documentation of specifity, linearity, precision and accuracy, recovery and stability makes clear that this method is suitable for the determination of Myrtol standardized in the perfusate samples. Because of the volatile property of essential oils you should have to direct the attention to a possible contamination of the samples. It is necessary to consider this during laboratory work and sample collection at the bovine udder. First investigations with the isolated perfused bovine udder showed that the two compounds α-pinene and R-limonene could not be determinated if Tyrode solution was used for the perfusion. 1,8-cineole was detected in very low concentrations. This led to different studies and finally to a slightly modification of the experimental design: The perfusion was made with a tyrode-milk-mixture in a ratio of 1:1. 0,6 ml of Myrtol standardized or 0,6 ml of the single compounds α-pinene, R-limonene and 1,8-cineole respectively were administered. The perfusion lasted 4 hours. Besides perfusate samples tissue samples from the teat mucosa of the treated teats made by a microtome were collected and also analysed. The main studies were carried out with Myrtol standardized at six bovine udders. Additionally there were six udders, each with the specially prepared single compounds α-pinene, R-limonene and 1,8-cineole. Within the whole perfusion 0,003 mg α-pinene, 0,022 mg R-limonene and 7,16 mg 1,8-cineole by administration of Myrtol standardized got to the perfusate. This is a percentage of 0,01 % α-pinene, 0,022 % R-limonene and 7,16 % 1,8-cineole, if a content of 26,67 mg α-pinene, 100 mg R-limonene and 100 mg 1,8-cineole is considered in 0,6 ml of Myrtol standardized. With administration of the single compounds 0,0038 mg α-pinene, 0,0021 mg R-limonene and 3,93 mg 1,8-cineole got into the perfusate. This is a percentage of 0,009 % α-pinene, 0,001 % R-limonene and 2,2 % 1,8-cineole. It is observed that the compounds α-pinene and R-limonene were not always detectable although there were efforts to optimize the perfusate. The detectable concentrations in the tissue samples were clearly higher and there was no concentration gradient. All three compounds were detectable. The results of the presented study show that the three compounds of the essential oil preparation Myrtol standardized are absorbed from the teat mucosa and released to the perfusate in principle. The comparatively low percentages of the total amount in the perfusate in comparison to the original administered amount show parallels to the results from a study with human beings. The tissue samples, analysed in the same way, make clear that the high lipophilic substances remain in the teat tissue. The high variation between the single results is in all probability because of the different bovine udders. The use of the isolated perfused bovine udder for studies concerning the absorption of intracisternally administered essential oils is therefore possible on principle.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Resorption intrazisternal applizierter Substanzen am isoliert perfundierten Rindereuter untersucht. Die dabei angewandte Substanz Myrtol standardisiert ist Wirkstoff eines humanmedizinischen Fertigarzneimittels, das als magensaftresistente Kapsel eingenommen und vornehmlich im Dünndarm resorbiert wird. Zusätzlich sollte eine Methode zur Analyse der drei Hauptkomponenten des Myrtol standardisiert α-Pinen, R-Limonen und 1,8-Cineol entwickelt werden. Literaturdaten zeigen, dass die drei Komponenten des Myrtol standardisiert beim Menschen nur in Konzentrationen im Nanogramm-Bereich im Plasma nachgewiesen werden können. Voraussetzung für die Analyse der Einzelkomponenten des Myrtol standardisiert im Perfusat des isoliert perfundierten Rindereuters war demnach eine selektive Methode mit niedriger Nachweisgrenze. Durch den Einsatz eines Gaschromatographen mit massenselektivem Detektionssystem im PCI-Modus wurde eine Nachweisgrenze von 2,0 ng/ml erreicht. Eine durchgeführte Vorstudienvalidierung mit Dokumentation von Spezifität, Linearität, Präzision und Richtigkeit, Wiederfindungsrate und Stabilität verdeutlicht die Eignung dieser Methode zur Analytik von Myrtol standardisiert in den Proben des Rindereutermodells. Besonderes Augenmerk muss aufgrund der Flüchtigkeit der ätherischen Öle auf eine mögliche Kontamination der Proben gelegt werden. Bei der Aufarbeitung der Proben wie auch bei ihrer Gewinnung am Rindereutermodell ist dies zu berücksichtigen. Erste Untersuchungen am isoliert perfundierten Rindereuter ergaben, dass die beiden Komponenten α-Pinen und R-Limonen bei Einsatz von Tyrodelösung als Perfusionslösung nicht nachgewiesen werden konnten. 1,8-Cineol war in sehr geringen Konzentrationen nachweisbar. Dies machte verschiedene Untersuchungen nötig, die schließlich zu einer leichten Modifikation des Versuchsaufbaus führten: Die Perfusion wurde mit einem Tyrode-Milchgemisch im Verhältnis 1:1 durchgeführt. Zur Applikation kamen 0,6 ml Myrtol standardisiert bzw. 0,6 ml der jeweiligen Einzelkomponenten α-Pinen, R-Limonen und 1,8-Cineol. Die Perfusion erstreckte sich über 4 Stunden. Neben Perfusatproben wurden von der Zitzenschleimhaut der behandelten Zitzen Gewebeschnitte mittels Gefriermikrotom gewonnen und ebenfalls analysiert. Die Hauptuntersuchungen wurden mit Myrtol standardisiert an sechs Rindereutern durchgeführt. Zusätzlich wurden an je sechs Rindereutern die speziell angefertigten Einzelsubstanzen α-Pinen, R-Limonen und 1,8-Cineol appliziert. Über den gesamten Perfusionszeitraum gelangten bei Applikation von Myrtol standardisiert 0,003 mg α-Pinen, 0,022 mg R-Limonen und 7,16 mg 1,8-Cineol in das Perfusat. Berücksichtigt man einen Gehalt von 26,67 mg α-Pinen, 100 mg R-Limonen und 100 mg 1,8-Cineol in 0,6 ml Myrtol standardisiert, entspricht dies einem prozentualen Übergang von 0,01 % α-Pinen, 0,022 % R-Limonen sowie 7,16 % 1,8-Cineol. Bei Applikation der Einzelsubstanzen gelangte 0,0038 mg α-Pinen, 0,0021 mg R-Limonen bzw. 3,93 mg 1,8-Cineol in das Perfusat. Dies entspricht einem prozentualen Übergang von 0,009 % bei α-Pinen, 0,001 % bei R-Limonen und 2,2 % bei 1,8-Cineol. Anzumerken ist, dass die Komponenten α-Pinen und R-Limonen trotz versuchter Optimierung der Perfusionslösung nicht bei jedem Euter nachweisbar waren. Die nachgewiesenen Konzentrationen in den Gewebeschnitten waren deutlich höher und zeigten kein Konzentrationsgefälle. Alle drei Komponenten waren nachweisbar. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die drei Komponenten des Ätherisch-Öl-Präparates Myrtol standardisiert grundsätzlich von der Zitzenschleimhaut aufgenommen und an die Perfusionsflüssigkeit abgegeben werden. Die relativ niedrigen Prozentsätze der in das Perfusat übergegangenen Gesamtmenge im Vergleich zur ursprünglich applizierten Grundmenge zeigen durchaus Parallelen zu den Ergebnissen einer Studie beim Menschen. Die ebenfalls analysierten Gewebeschnitte verdeutlichen den Verbleib der stark lipophilen Substanzen im Zitzengewebe. Die starke Streuung der Einzelergebnisse liegt höchstwahrscheinlich an den unterschiedlichen Rindereutern. Eine Nutzung des isoliert perfundierten Rindereuters für Untersuchungen zur Resorption intrazisternal applizierter ätherischer Öle ist demnach prinzipiell möglich.

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Maurer, Kathrin: Untersuchungen zur Resorption von ätherischen Ölen über die Zitzenschleimhaut am isoliert perfundierten Rindereuter. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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