Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Computermikrographische Analyse morphofunktioneller Veränderungen an flüssig- und tiefgefrierkonserviertem Pferdesamen und deren Beziehung zur Fertilität

Reinstorf, Frauke

In this study ejaculates of stallions belonging to the National Stud Lower Saxony (Celle, Germany) were evaluated under the aspect of morphofunctional alterations in fresh and frozen-thawed semen. The objective of this study was to analyse, the repeatability of the methods of examination and the influence of centrifugation and cryopreservation on the quality of fresh and frozen-thawed stallion semen. In the first analyse 12 ejaculates of 4 stallions on three following days and in the second analyse, 10 ejaculates of 10 stallions were evaluated. In the main experiment fresh-diluted semen and frozen-thawed semen from 207 ejaculates of 69 stallions were evaluated. The results for fresh and frozen semen were compared and related to seasonality and fertility. Parameters were evaluated by means computer-assisted sperm analysis, computer-assisted measurement of the hypoosmotic swelling ability, analySIS®3.0 for the live/dead-staining and flowcytometry. Furthermore, the morphology and the CFDA/PI-staining were analysed subjectively. There was no possibility to evaluate FITC/PNA-staining and JC-1-staining by means analySIS®3.0 software, because this software was not able to analyse different structures within sections of spermatozoa.  Significant correlations between the results of repeated measurements of identic samples proved the repeatability of the methods. Centrifugation had an obvious impact on spermatofunctional parameters of fresh horse semen. Thus the percentage of viable and acrosome intact spermatozoa decreased in the centrifuged, diluted semen. Viability in the supernatant fluid decreased. After cryopreservation there were less viable and acrosome intact spermatozoa in comparison to diluted semen and centrifuged, diluted semen. A 3- hour- storage of semen samples at room temperature had no significant influence except a decrease of spermatozoa with an intact acrosome and a high mitochondrial membrane potential. After a longtime storage there was a decrease of viability and a increase of the percentage of acrosome reacted spermatozoa within the same semen samples. Compared to diluted semen there is a higher motility and a higher percentage of acrosome reacted spermatozoa in the centrifuged, diluted semen after 48h storage at 5°C. Statistically significant seasonal differences were shown for the morphology and the fresh and frozen-thawed semen. There was in total a lower quality in semen parameters in the beginning of the breeding season except of a lower percentage morphological abnormal sperm cells. The comparison of fresh and frozen semen demonstrated that motility in fresh semen and the percentage of viable and acrosome intact spermatozoa in frozen semen were related. Viability after cryopreservation correlated positively with viability and acrosome integrity in fresh semen. Additionally, the amount of acrosome reacted spermatozoa in fresh semen correlated inversely with the amount of acrosome intact spermatozoa in frozen semen. Motility an acrosomal integrity of fresh semen are useful to predict quality of frozen semen. Especially sperm morphology, viability, mitochondrial membrane potential and  total increase of acrosome reacted spermatozoa after induction of the acrosome reaction showed high interindividual variation. Fertility was predominantly related to motility, viablity, acrosome integrity and to the percentage of acrosome reacted spermatozoa after addition of heparin of fresh semen. For frozen semen it was demonstrated that fertility and the amount of mitochondrial active spermatozoa  correlated. With regard to sperm morphology spermatozoa with separated heads or distal droplets and the total number of morphological alterations had a detrimental effect on fertility. After dividing fertility parameters into quartiles and percentiles there were seen mostly higher values in the middle quartiles, in the fourth quartile and in the last percentile. These results could be used to develop thresholds and minimum values of functional sperm parameters. In conclusion this study includes following aspects concerning the equine artificial insemination practice as well as fertility prognosis of equine ejaculates and of stallions: Centrifugation has an obvious impact on longtime storage of fresh semen concerning the viability and motility. The supernatant fluid can be used for directly insemination because of high numbers of viable spermatozoa. Forward motility and acrosome intact spermatozoa are an indicator for deep freezing suitability. The few correlations between semen parameters and fertility can be judged positively viewing the multifactorial event of fertilization. Dividing fertility parameters into quartiles and percentiles seems to give better fertility prognosis and seems to be better to develop thresholds and minimum values for fresh and frozen semen.

In dieser Arbeit wurden an Ejakulaten von Hengsten des Niedersächsischen Landgestütes in Celle morphofunktionelle Veränderungen an flüssig- und tiefgefrierkonserviertem Samen untersucht. Eine Prüfung der Reproduzierbarkeit der Beurteilungsmethoden von frisch- und tiefgefrierkonserviertem Pferdesamen wurde vorgenommen und der Einfluss verschiedener Aufbereitungsverfahren auf die Qualität von Frisch- und Tiefgefriersamen analysiert. Es standen für die Prüfung der Methode insgesamt 12 Ejakulate von vier Hengsten an drei aufeinanderfolgenden Tagen zur Verfügung. Für den Versuch zur Überprüfung des Einflusses von Aufbereitungsverfahren auf die Samenqualität wurden 10 Ejakulate von 10 Hengsten untersucht. Im Hauptversuch erfolgte eine Analyse von frischverdünntem sowie tiefgefrorenem Samen an insgesamt 207 Ejakulaten von 69 Hengsten zu drei verschiedenen Jahreszeiten (3 Ejakulate/Hengst). Die Ergebnisse wurden einander gegenübergestellt und deren Bezug zur Saisonalität und Fertilität ermittelt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe einer automatisierten Motilitätsanalyse, einer computergestützten Messung des hypoosmotischen Schwellvermögens, dem Bildanalysesystem analySIS®3.0 für die Lebend/Tot-Färbung und  der Durchflusszytometrie. Die Auswertung der morphologischen Färbung und der CFDA-PI-Färbung erfolgte subjektiv. Für die Parameter der FITC/PNA-PI-Färbung und der JC-1-Färbung erfolgte ebenfalls eine subjektive Auswertung nach einer Klasseneinteilung, da die Software von analySIS®3.0 bestimmte Abschnitte des Spermiums nicht als eine Einheit erfassen und darin Differenzierungen vornehmen konnte. Die Ergebnisse der zweifachen, identischen Probenwiederholung korrelierten signifikant miteinander (P ≤ 0,05) und konnten die Wiederholbarkeit der Methode und somit einen geringen methodischen Fehler der Untersuchungen herausstellen. Die Zentrifugation hatte einen Einfluss auf die Spermienfunktion von flüssigkonserviertem Pferdesamen. Die Werte der Spermienfunktionen sind im Resuspendat signifikant niedriger als in der verdünnten Probe. Im Überstand konnte direkt nach der Zentrifugation eine erhöhte Anzahl an lebenden Spermien festgestellt werden. Nach der Tiefgefrierung lagen die Werte hinsichtlich der Motilität, Lebensfähigkeit und der Akrosomintegrität signifikant unter denen des verdünnten und resuspendierten Samens (P ≤ 0,05). Eine längere Lagerung der Proben bei Raumtemperatur vor der Tiefgefrierung wirkte sich ausgenommen von geringeren Werten an akrosomintakten Spermien und Spermien mit hohem Membranpotential nicht negativ aus. Eine Langzeitlagerung führte innerhalb der verdünnten Proben, der Resuspendate und der Überstände zu einer deutlichen Abnahme der lebenden Spermien und zu einer Zunahme der akrosomreagierten Spermien. Zentrifugierte und resuspendierte Samenproben wiesen nach einer Lagerung für 48 h bei 5°C die höchsten Motilitäten und die höchste Anzahl an lebenden Samenzellen auf. Im Überstand waren nach 48 h keine überlebenden Samenzellen mehr nachweisbar. Ein Einfluss der Saison konnte auf die Morphologie und die Qualität von Frisch- und  Tiefgefriersamen festgestellt werden. Eine insgesamt herabgesetzte Qualität der Spermienfunktion ist mit Ausnahme von einer geringeren Anzahl an morphologischen Veränderungen zu Beginn der Saison im Frühjahr zu erkennen. Der Vergleich von Frischsamen und Tiefgefriersamen zeigte positive Korrelationen von der Vorwärtsmotilität des Frischsamens zu lebenden und akrosomintakten Spermien im Tiefgefriersamen. Lebende Spermien des Tiefgefriersamens korrelierten positiv mit den akrosomintakten, lebenden Spermien des Frischsamens. Es stellten sich die Motilität und die Akrosomintegrität des Frischsamens als geeignet für eine Qualitätsprognose des Tiefgefriersamens heraus. Hohe interindividuelle Schwankungen ergaben sich hinsichtlich der Morphologie, der Lebensfähigkeit, der Motilität, des mitochondrialen Membranpotentials und des Zuwachses an akrosomreagierten Spermien nach Induktion der Akrosomreaktion. Eine positive Korrelation zur Fertilität bestand beim Frischsamen für die Vorwärtsmotilität,  für lebende und akrosomintakte Spermien sowie für lebende und akrosomreagierte Spermien nach der Zugabe von Heparin. Die Untersuchungen des Tiefgefriersamens zeigten lediglich eine positive Korrelation der mitochondrial aktiven Samenzellen zur Fertilität. Bei den morphologischen Veränderungen korrelierten Halsbrüche, distale Plasmatropfen und die Anzahl an morphologischen Gesamtveränderungen negativ mit der Fertilität. Die Ergebnisse der Quartil- und Perzentileinteilung erbrachten überwiegend höhere Werte in den mittleren Quartilen, im vierten Quartil sowie im letzten Perzentil und  könnten somit für eine Erstellung von Schwellenwerten und Mindestwerten genutzt werden. Für die Pferdebesamungspraxis, sowie für die Beurteilung der Fertilitätsaussichten equiner Ejakulate bzw. von Hengsten ergibt sich zusammenfassend aus der vorliegenden Arbeit: Die Zentrifugation erweist sich für eine Langzeitlagerung von Frischsamen hinsichtlich der Lebensfähigkeit und Motilität der Spermien als positiv. Überstand kann für eine direkte Besamung aufgrund seines hohen Anteils an lebenden Spermien genutzt werden. Für die Prognose hinsichtlich Tiefgefriereignung eignen sich die Vorwärtsmotilität und die akrosomintakten, lebenden Spermien im Frischsamen. Für eine Fertilitätsprognose sind die Samenparameter von Frisch- und Tiefgefriersamen in dieser Studie nicht geeignet, vielmehr eignen sie sich für eine Qualitätsprognose. In Anbetracht des multifaktoriellen Geschehens des Befruchtungsvorganges können die wenigen erhaltenden Korrelationen der spermatologischen Parameter zur Fertilität jedoch als positiv gewertet werden. Eine Quartil- und Perzentileinteilung der Fertilitätsparameter scheint bessere Fertilitätsaussagen zu ergeben und bei der Erstellung von Mindest- und Schwellenwerten hinsichtlich der Qualität von Frisch- bzw. TG-Samen besser geeignet.

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Reinstorf, Frauke: Computermikrographische Analyse morphofunktioneller Veränderungen an flüssig- und tiefgefrierkonserviertem Pferdesamen und deren Beziehung zur Fertilität. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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