Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse

Schröder, Anke

As to the diagnosis of mastitis the differential cell count is a well known criterion. The classification of the big mononuclear cells as either epithelial cells or macrophages has a long and varied history, just as in the practical experience of many researchers an objective microscopical cell differentiation proves to be complicated by the low quality of milk smears in comparison to blood ones. This study was focused on the relevance of cell differentiation in milk and blood with consideration of udder health and technical questions concerning laboratory work. For this purpose, the cell differentiation was done not only microscopically, but also by flow cytometry using monoclonal antibodies. As the presented data confirm, the differential cell count – regardless of microscopic or flow cytometric origin – is superior to selected criteria of udder health (somatic cell count, NAGase, electrical conductivity) in the diagnosis of mastitis. This became evident in the further analysis of the differential cell count with consideration of the udder health, which revealed significant (p < 0,05) differences between the physiological reference and those udder quarters of mastitic cows which were defined as healthy according to selected criteria of udder health. On the other hand, this proves that mammary quarters of one bovine udder influence each other functionally and do not react independently. By microscope a differential cell count of 34 % PMN, 25 % lymphocytes and 39 % macrophages were determinded as physiological reference. In case of severe mastitis, 80 % PMN, 7 % lymphocytes and 13 % macrophages were found. Bo116, an antibody which binds to a not yet characterized structure on the surface of PMN, shows – due to mastitis – a significant (p < 0,05) rise in the proportion of positive cells of 5 % to 24 % in combination with a parallel decrease in the expression density. Other parameters which were significantly (p < 0,05) influenced by the udder health status were cell viability as well as the proportion of positive cells and the expression density of CD4, CD8, TCR1 for lymphocytes and CD14 for macrophages. Above all, the changes of the parameters measured by means of flow cytometry, but also the changes observed by microscope showed the same tendency when blood was examined. As the study on analytical questions showed, the following conditions of sampling and preparation should be observed for microscopic cell differentiation: ·        Samples should be taken and transported in glass containers, as plastic leads to a reduction of the phagocyte population, especially of macrophages. ·        Only results obtained by the same person are comparable. ·        Only smears prepared with identical technique give comparable results. The preparation of the “Kieler Sedimentausstrich” is based on a single centrifugation followed by spreading the cell-enriched sediment with a loop. In comparison to “Kaffeemühle” this technique leads to significantly (p < 0,05) more lymphocytes and less PMN in the differential cell count. In contrast to the “Kieler Sedimentausstrich” in the procedure “Kaffeemühle”, the sediment obtained by the first centrifugation is washed thrice and then spread on a cover glass with the aid of centrifugal force. Flow cytometry in combination with membrane immunofluorescence, i.e. the staining of structures on the cell surface using fluorochrom-conjugated specific antibodies, opens the possibility of an objective and in comparison to the microscopic evaluation preciser cell differentiation, which cannot only describe the cell type but functional type and state of the cell as well. The research into the relevance of the differential cell count thus obtained allows the following statements with consideration to udder health and technical conditions: ·        The results of the flow cytometric cell differentiation may not be compared directly to those gained by microscope, as long as the antibodies used do not bind to all stages of development of exclusively one cell type. ·        Flow cytometry allows an independent cell differentiation, which includes beyond a strictly morphological view changes on the cell surface and of the cell viability. ·        The selection of the monoclonal antibodies is of great importance, i.e. not all antibodies available in the bovine system can be used to stain milk cells. In case of lymphocytes, one cause is the varying tissue distribution of subpopulations. On the surface of almost all gd-T-lymphocytes in blood, WC1 can be observed, whereas in milk this structure can only be detected on a small population of gd-T-lymphocytes. As to CD4 it was shown that antibodies of the same specificity, but of different origin, will bind to a significantly different proportion of milk lymphocytes.

Das Differentialbild der Milchzellen ist ein seit langem bekanntes Kriterium für die Diagnose von Mastitiden. Die wechselvolle Geschichte der Zuordnung der großen mononukleären Zellen zu den Epithelzellen oder den Makrophagen belegt die praktische Erfahrung vieler Untersucher, daß aufgrund der im Vergleich zum Blut geringen Qualität der Ausstriche eine objektive mikroskopische Zelldifferenzierung erschwert ist. In dieser Arbeit wurden die Aussagefähigkeit des Zelldifferentialbildes in Milch und Blut unter Berücksichtigung von Eutergesundheit und labortechnischen Fragestellungen überprüft. Zu diesem Zweck wurde das Zelldifferentialbild nicht nur mikroskopisch, sondern auch durchflußzytometrisch mit Hilfe monoklonaler Antikörper ermittelt. Wie die dargestellten Daten belegen, ist das Zelldifferentialbild – unabhängig davon, ob es mikroskopisch oder durchflußzytometrisch erstellt wurde – den selektierten Kriterien der Eutergesundheit (Zellgehalt, NAGase, elektrische Leitfähigkeit) in der Mastitisdiagnostik überlegen. Dies zeigte sich bei der differenzierten Betrachtung des Zelldifferentialbildes unter Berücksichtigung der Eutergesundheit darin, dass signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen der physiologischen Referenz und den nach selektierten Kriterien als gesund definierten Vierteln euterkranker Kühe bestanden. Das bedeutet wiederum, dass die zu einer Milchdrüse gehörenden Euterviertel sich gegenseitig funktionell beeinflussen und nicht unabhängig voneinander reagieren. Als physiologische Referenz wurde ein mikroskopisches Zelldifferentialbild von 34 % PMN, 25 % Lymphozyten und 39 % Makrophagen ermittelt. Bei hochgradiger Mastitis wurden dagegen 80 % PMN, 7 % Lymphozyten und 13 % Makrophagen nachgewiesen. Bo116, ein Antikörper gegen eine nicht näher charakterisierte Oberflächenstruktur der PMN, zeigt eine mastitisbedingte signifikante (p < 0,05) Erhöhung der Expressionsrate von 5 % auf 24 % und eine parallele Verringerung der Expressionsdichte. Ebenso konnten signifikante (p < 0,05) Einflüsse der Eutergesundheit auf die Zellvitalität sowie auf die Expressionsrate und –dichte von CD4, CD8, TCR1 für Lymphozyten und CD14 für Makrophagen beobachtet werden. Vor allem die durchflußzytometrisch, aber auch die mikroskopisch beobachteten Veränderungen ergaben sich tendenziell auch für die Blutleukozyten. Wie die Untersuchungen zu analytischen Fragestellungen zeigten, sind für die mikroskopische Ermittlung des Zelldifferentialbildes folgende Bedingungen für Probenahme und Präparation einzuhalten: ·        Die Proben sollten in Glasgefäßen genommen und transportiert werden, da Kunststoff zu einer Verringerung des Anteils der Phagozyten, vor allem der Makrophagen, führt. ·        Nur Ergebnisse desselben Untersuchers sollten miteinander verglichen werden. ·        Nur mit identischer Technik hergestellte Ausstriche ermöglichen vergleichbare Ergebnisse. Die Herstellung von Kieler Sedimentausstrichen beruht auf einer einmaligen Zentrifugation und dem Ausstreichen des zellreichen Sediments mit einer Öse. Im Vergleich zur „Kaffeemühle“ werden mit dieser Technik bei der Zelldifferenzierung signifikant (p < 0,05) mehr Lymphozyten und weniger PMN festgestellt. Im Gegensatz zur Präparation des Kieler Sedimentausstrichs wird bei dem Verfahren „Kaffeemühle“ das nach der ersten Zentrifugation erhaltene Sediment dreimal gewaschen und dann mit Hilfe der Zentrifugalkraft auf einem Deckgläschen verteilt. Die Durchflußzytometrie in Kombination mit der Membranimmunfluoreszenz, d.h. der Markierung von Zelloberflächenstrukturen mit Hilfe fluorochrommarkierter spezifischer Antikörper, eröffnet die Möglichkeit einer objektiven und im Vergleich zum Mikroskop weitergehenden Zelldifferenzierung, die über die Zellartbestimmung hinaus den Funktionstyp und –zustand der Zelle beschreiben kann. Die Untersuchungen zur Aussagefähigkeit des derart ermittelten Zelldifferentialbildes lassen unter Berücksichtigung von Eutergesundheit und technischen Voraussetzungen folgende Aussagen zu: ·        Das durchflußzytometrisch ermittelte Zelldifferentialbild ist nicht direkt mit dem mikroskopisch ermittelten vergleichbar, solange die eingesetzten Antikörper nicht an alle Entwicklungsstadien ausschließlich einer Zellart binden. ·        Die Durchflußzytometrie ermöglicht eine eigenständige Differenzierung der Milchzellen, die über die rein morphologische Betrachtung hinaus auch Veränderungen der Zelloberfläche sowie der Zellvitalität mit einschließt. ·        Die Auswahl der monoklonalen Antikörper ist von großer Bedeutung, d.h. nicht alle im bovinen System zur Verfügung stehenden Antikörper sind für die Markierung von Milchzellen geeignet. Für die Lymphozyten liegt dies zum einen an der unterschiedlichen Gewebeverteilung der Subpopulationen. So tragen zwar im Blut fast alle gd-T-Lymphozyten WC1 auf ihrer Oberfläche, in der Milch dagegen nur ein sehr kleiner Teil. Zum anderen konnte für CD4 dargelegt werden, dass Antikörper mit der gleichen Spezifität, aber verschiedener Herkunft, an einen signifikant unterschiedlich großen Anteil der Milchlymphozyten binden.

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Schröder, Anke: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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