Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Circadiane mRNA-Expression des MT1-Melatonin-Rezeptors im Hypothalamus alternder Mäuse

Wiegand, Britta

The aim of the present study was the comparison of normally fed, caloric restricted (CR) and melatonin-substituted aged animals at the molecular level. For this purpose we examined the MT1-melatonin-receptor-mRNA-expression in hypothalamic tissue at different times of the day. For the systematic in-vivo-examination we decided to use a mouse-model. The animals were housed individually and maintained in a light-dark-cycle with lights on from 6:00 to 18:00 h for 55 weeks. Throughout this period a strict feeding-regime for each group was maintained. At the end of the experiment caloric restricted animals had a significantly lower body weight than the normally fed- and melatonin-substituted animals. The mRNA-concentration was examined at different timepoints (6:00 h/ZT 0, 12:00 h/ZT 6, 18:00 h/ZT 12 and 24:00 h/ZT 18) by quantitative real-time-PCR using the light cycler instrument. Statistical analysis of the data used a „two-way analysis of variance” (ANOVA) to compare the three groups over 24 h. Only at 6:00 h (ZT 0), i. e. at the end of the subjective night, was a significant difference in the hypothalamic MT1-mRNA-expression of the three groups with highest expression in the normally fed-group, lower expression in the CR-group and lowest in the melatonin-substituted group observed. Both interventions, melatonin-substitution and caloric restriction seemed to have an influence on the MT1-receptor-mRNA-expression at that timepoint. At the 12:00 h, 18:00 h and 24:00 h timepoints there were no significant differences among the different feeding regimes. The animals of the melatonin-group showed a consistently low MT1-mRNA-expression at the four  timepoints. The determination of the melatonin-serum-concentrations by a „time resolved fluorescence immunoassay” (TRFIA) indicated that the mouse-strain B6C3F1 is a melatonin-proficient strain. The normally fed animals did not show any significant variation of the melatonin concentrations throughout 24 hours. The CR-animals had a significantly increased serum concentration at the 18:00 h/ZT 12 and the melatonin-animals had progressively higher melatonin concentrations from 18:00 h/ZT 12 to 6:00 h/ZT 0. At 18:00 h/ZT 12 the locomotor activity started and thereby the melatonin-substituted animals started drinking water with melatonin. At midnight the melatonin-animals showed a five-fold, at 6.00 h a fifty-fold increased serum-melatonin-concentration as compared to the other groups. Thus, a negative correlation between the MT1-mRNA-expression and the serum-melatonin-concentration at the 6.00 h/ZT 0 was observed. Northern blot analysis from hypothalamic tissue of mice revealed an extremely low MT1-mRNA-expression. There was a major hybridizing transcript of 1.6-1.8 kb and a minor one of 7-9 kb. Coronal brain sections were examined by in situ hybridisation with an 35S-labeled antisense or sense cRNA probe. There were diffuse signals in the temporal cortex, the anterior hypothalamic area, the ependyma of the ventricle, the pars tuberalis of the hypophysis and the nuclei paraventriculares and subparafasciculares of the thalamus, but no distinct signal in the SCN of mice. However coronal sections of Phodopus sungorus revealed an intense signal in the SCN. The in situ hybridisation confirmed once more the extremely low expression of the MT1-mRNA in the suprachiasmatic nuclei of Mus musculus. The MT1-mRNA was analysed semiquantitative for its expression pattern in different murine tissues by standard-PCR. MT1 was present in all tissues with maximum expression in testis. There was a distinct MT1-signal in the hypothalamus and in the whole embryo, a weaker signal in total brain, heart, liver and kidneys and the weakest signal in epididymis, spleen and lung.     The results showed the effect of melatonin-substitution and caloric restriction at a molecular level in terms of the circadian MT1-mRNA-expression in the suprachiasmatic nuclei of aged mice. Both interventions suppressed the mRNA-expression at one timepoint (ZT 0). Caloric restriction is the only intervention that retards the development of a broad spectrum of age-associated pathological and physiological changes and increases maximum life span. In some cases melatonin substitution shows the same physiological changes as CR. With respect to the aging process the MT1-melatonin-receptor-gene could possibly be a common point on which both caloric restriction and melatonin-substitution act. Thus, melatonin-substitution might be an alternative to CR in retarding some aspects of the aging process.

Ziel der vorliegenden Arbeit war der Vergleich normal gefütterter, kalorisch restriktiv (KR) gefütterter und Melatonin-substituierter älterer Tiere auf molekularer Ebene. Dazu wurde die MT1-Rezeptor-mRNA-Expression im Hypothalamus vergleichend im circadianen Verlauf  untersucht. Für systematische in-vivo-Untersuchungen wurde ein Maus-Modell gewählt. Die Haltung der Tiere erfolgte in Einzelkäfigen unter einem Hell-Dunkel-Zyklus mit Licht von 6.00 (ZT 0) bis 18.00 Uhr (ZT 12) und mit einem strengen Fütterungsregime über 55 Wochen. Das Körpergewicht der KR-Tiere lag zum Tötungszeitpunkt signifikant unter jenem der Melatonin- und Normal-Tiere. Durch eine quantitative Echtzeit-PCR am Light-Cycler wurde die MT1-Rezeptor-mRNA-Konzentration der Versuchtiergruppen zu vier verschiedenen Zeitpunkten untersucht (6.00 Uhr/ZT 0, 12.00 Uhr/ZT 6, 18.00 Uhr/ZT 12  und 24.00 Uhr/ZT 18) und im statistischen „two-way ANOVA”-Prüfverfahren auf ihre Signifikanz untersucht. Nur zum 6.00-Uhr-Zeitpunkt (ZT 0), zum Ende der subjektiven Nacht, zeigten sich signifikante Unterschiede der hypothalamischen MT1-mRNA-Konzentration zwischen den drei Gruppen mit der höchsten Expression in der Normalgruppe, einer niedrigeren Expression in der KR-Gruppe und der niedrigsten Expression in der Melatonin-Gruppe. Beide Interventionen, Melatonin-Substitution und KR, schienen zu diesem Zeitpunkt Einfluss auf die MT1-Expression zu nehmen. Zum 12.00-, 18.00- und 24.00-Uhr-Zeitpunkt zeigten sich weder signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten, noch zwischen den verschiedenen Tiergruppen. Die Melatonin-substituierten Tiere zeigten eine konstant niedrige Expression zu den vier Zeitpunkten. Die Untersuchung der Melatonin-Serum-Konzentration im TRFIA („time resolved fluorescence immunoassay”) zeigte, dass es sich bei den in diesem Versuch eingesetzten Mäusestamm B6C3F1 tatsächlich um einen Melatonin-profizienten Stamm handelt.  Die Bestimmung der Melatonin-Serum-Konzentration zeigte keine signifikanten Veränderungen  im circadianen Verlauf bei den Normaltieren. Die KR-Tiere zeigten zum 18.00-Uhr-Zeitpunkt (ZT 12) eine signifikante Erhöhung der Melatonin-Serum-Konzentration und die Melatonin-substituierten Tiere zeigten mit beginnender Aktivität in der Dunkelphase – und damit beginnender Aufnahme Melatonin-haltigen Trinkwassers – von 18.00 (ZT 12) bis 6.00 Uhr (ZT 0) eine progressive Erhöhung der Melatonin-Serum-Konzentration. Um 24.00 Uhr war die Konzentration etwa um das fünffache, um 6.00 Uhr etwa um das fünfzigfache gegenüber den beiden anderen Gruppen erhöht. Damit zeigte sich eine negative Korrelation der MT1-mRNA-Expression zur Melatonin-Serum-Konzentration zum 6.00-Uhr-Zeitpunkt. In der Northern-Blot-Analyse wurde eine extrem geringe MT1-mRNA-Expression im Hypothalamus der Maus nachgewiesen. Es konnte ein Hauptranskript mit der Grösse von 1,6-1,8 kb detektiert werden. Eine Nebenbande zeigte sich bei 7-9 kb. Die regionale Verteilung des MT1-Transkripts wurde an kryologischen Schnitten durch in-situ-Hybridisierung mit einer [α-35S]-gelabelten cRNA-Sonde untersucht. An kryologischen Schnitten des murinen Gehirns konnten positive Hybridisierungssignale in verschiedenen Regionen (temporaler Cortexbereich, vordere hypothalamische Region, Ependym der Ventrikel, Pars tuberalis der Hypophyse, Nuclei paraventriculares und subparafasciculares des Thalamus), jedoch nicht in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus detektiert werden. Kryologische Schnitte der Spezies Phodopus sungorus zeigten nach identischer Hybridisierung dagegen ein deutliches Signal in den suprachiasmatischen Nuclei. Dies zeigte erneut die extrem geringe Expression der MT1-mRNA-Expression in den suprachiasmatischen Nuclei der Spezies Mus musculus. Ein semiquantitativer Vergleich der MT1-mRNA-Expression in verschiedenen Geweben von Mus musculus mittels Standard-PCR verdeutlichte die ubiquitäre Verteilung des MT1-Rezeptors. Dabei zeigte sich eine Verteilungstendenz zwischen den verschiedenen Geweben mit dem stärksten Signal im Hodengewebe und einem deutlichen Signal im Hypothalamus und im Gesamt-Embryo. Das amplifizierte Produkt zeigte in Gesamtgehirn, Herz, Leber und Niere eine schwächere Bande und die schwächsten Banden in Nebenhoden, Milz und Lunge.   Die Ergebnisse zeigten die Auswirkung der Melatonin-Substitution und kalorischen Restriktion auf molekularer Ebene anhand der circadianen MT1-mRNA-Expression im Hypothalamus älterer Mäuse. Beide Interventionen supprimierten die mRNA-Expression zu einem Zeitpunkt (ZT 0). Die einzige Intervention, die nachweislich den Alterungsprozess verlangsamen kann, ist die kalorische Restriktion. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Melatonin-Substitution in vielen Fällen gleiche charakteristische physiologische Veränderungen hervorruft. Nach diesen Untersuchungen könnte möglicherweise das MT1-Melatonin-Rezeptor-Gen einen Schnittpunkt von kalorischer Restriktion und Melatonin-Substitution hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Alterungsprozess darstellen. Damit stände möglicherweise eine alternative Strategie zur kalorischen Restriktion zur Verfügung. 

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Wiegand, Britta: Circadiane mRNA-Expression des MT1-Melatonin-Rezeptors im Hypothalamus alternder Mäuse. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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