Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Verbreitung von Anthelminthikaresistenzen bei Pferden in Niedersachsen

Wirtherle, Nicole Catherine

The small strongyles belong to the most important parasites in horses all over the world, and due to the growing prevalence of anthelmintic resistance (AR) during these past years they have become even more important. Early detection as well as distinct knowledge about the mechanisms of resistance are essential for a successful control of AR. This study aims at investigating the prevalence of small strongyles as well as the incidence of AR in horses in Lower Saxony, Germany. Furthermore, an explorative analysis of data about the characteristics of the properties as well as pasture-management factors and anthelmintic regimes was performed in order to determine possible causes of AR. During the years 2000 and 2001, 1.383 fecal samples of 64 farms were tested for strongyle eggs. Of these 39,8 % were tested positive. Compared to the number of infected horses, prevalence on the properties turned out to be much higher; on 91,6 % of farms at least one animal was found to harbour strongyle infection. There was a significant difference in the mean fecal egg counts (FEC) between the years 2000 and 2001 although no obvious differences of property management or weather conditions were found. Significantly higher rates of infection were also found for horses younger than 5 years as well as for those that were kept on studs. Breed or gender did not influence the infection with strongyles. Measures of pasture hygiene, such as removing faeces and clipping roughs, significantly reduced the rate of infection. As for anthelmintic treatment IVM was used more frequently than other anthelmintics. Of those samples tested for AR, 73,3 % were positiv for benzimidazole (BZ) resistance according to at least one AR-assay. A faecal egg count reduction test (FECRT) and an egg hatch assay (EHA) was performed for 135 samples from 20 farms with fenbendazole (FBZ) and thiabendazole (TBZ) respectively. LD50-values > 0,1 mg/ml TBZ (COLES et al. 1992) and fecal egg count reduction (FECR) of < 90 % (BAUER 1986) were considered to indicate resistance. The results of both tests were correlated. The EHA was successfully performed for pyrantel (PYR) for the first time. Mean LD50-values of two PYR-sensitive small strongyle populations were 2,69 (± 1,65) and 13,95 (± 0,76) mg/ml PYR. More than 50 % of the 64 tested samples noticeably exceeded the higher value. Since there is no data of a known PYR-resistant strongyle population, no diagnosis concerning the prevalence of PYR-resistance could be made. Due to the low prevalence of small strongyles, FECRT with PYR could not be performed The FECRT with ivermectin (IVM) was performed for 77 horses on ten farms. A FECR of 100 % was found in all cases. Larval paralysis assays (LPA) performed on two IVM-sensitive strongyle populations resulted in mean LD50-values of 0,22 (± 0,2) and 0,36 (± 0,14) mg/ml IVM. The LD50-values found for 63 samples ranged between 0,11 and 2,31 mg/ml with a median of 0,76 mg/ml IVM. Similar to PYR, no diagnosis of IVM-resistance could be made by the in vitro test due to the lack of the threshold limits for resistance. According to the results of the FECRT with IVM, no detectable IVM-resistance has developed so far. Possibly due to the low number of farms on which AR-tests could be performed, no significant correlation was found between characteristics of the properties, pasture management factors and anthelmintic regimes as far as AR is concerned. Another method used for the detection of BZ-resistance was the allel-specific real-time PCR that was performed on adult worms and third stage larvae of small strongyles. This method allowed specific and reliable genotyping of the codon 200 in 53 adults and 102 larvae. The results showed allele frequencies of 66,7 % and 33,3 % in a BZ-resistant population of small strongyles for the TTC and TAC alleles respectively. The genotypes of adult worms were reproduceable and corresponded with earlier results of the conventional PCR. Since the quantitative analysis did not yield very destinct results this method is not suitable for routine diagnostics or clinical use in order to descern benzimidazole resistance.  

Die kleinen Strongyliden zählen weltweit zu den wichtigsten Parasiten des Pferdes und haben in den letzten Jahren aufgrund der Zunahme von Anthelminthikaresistenz (AR) immer mehr an Bedeutung gewonnen. Die möglichst frühe Diagnose einer AR sowie ein umfangreiches Wissen über die Resistenzmechanismen sind die wichtigsten Vorraussetzungen um Resistenz bekämpfen zu können. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Ermittlung der Prävalenz von kleinen Strongyliden sowie das Auftreten von AR bei Pferden in Niedersachsen, zum anderen sollte eine explorative Datenanalyse über Betriebsmerkmale, Weide- und Entwurmungsmanagement mittels einer Fragebogenerhebung Aufschlüsse über mögliche Zusammenhänge mit einer Resistenzproblematik geben. Insgesamt wurden in den Jahren 2000 und 2001 auf 64 Betrieben Kotproben von 1.383 Pferden auf den Befall mit Magen-Darm-Strongyliden (MDS) untersucht. Bei 39,8 % der Proben wurden MDS nachgewiesen. Auf 91,6 % der Betriebe wurde mindestens ein Tier mit MDS nachgewiesen, womit die betriebsbezogene Prävalenz wesentlich höher lag als die Prävalenz bei den Einzelproben. Die Prävalenz von MDS-Eiern im Kot und die mittleren EpG-Werte unterschieden sich in den beiden Probenjahren signifikant. Jungtiere zeigten signifikant höhere Eiausscheidungen als ältere Tiere. Bei Zuchtbetrieben wurde eine signifikant höhere Befallsrate festgestellt als bei den anderen Betriebsformen. Rasse und Geschlecht hatten keinen Einfluss auf den Befall mit MDS. Bei den Maßnahmen der Weidehygiene erreichte sowohl Kot- als auch Geilstellenentfernung eine signifikante Senkung der Befallsrate. Hinsichtlich des Entwurmungsmanagements stellte sich eine signifikante Häufung der Anwendung von IVM heraus. BZ-Resistenz konnte bei 73,3 % der auf AR untersuchten Proben mit mindestens einem AR-Test ermittelten werden. Zur Anwendung kam der Larvenschlupfhemmtest (LSHT) und der Eizahlreduktionstest (EZRT). Als Schwellenwerte dienten ein LD50-Wert von > 0,1 mg TBZ/ml (COLES et al. 1992) bzw. eine Eizahlreduktion (EZR) von < 90 % (BAUER 1986). Die Ergebnisse der beiden Tests korrelierten. Der LSHT wurde zum ersten Mal für PYR angewendet. Der Test ließ sich erfolgreich durchführen. LD50-Werte von zwei PYR-sensiblen kleinen Strongyliden-Populationen lagen zwischen 2,69 (± 1,65) mg PYR/ml und 13,95 (± 0,76) mg PYR/ml. Mehr als 50 % der Proben lagen deutlich über diesen Werten. Mangels Referenzwerte von PYR-resistenten Strongylidenpopulationen konnte keine Aussage hinsichtlich der Prävalenz einer PYR-Resistenz gemacht werden. Die Durchführung des EZRT mit IVM ergab in allen Fällen eine EZR von 100 %. Die Durchführung des Larvenparalysetest (LPT) mit IVM an dritten Larven von zwei IVM-sensiblen Strongylidenpopulationen ergaben Mittelwerte für die LD50 von 0,22 (± 0,2) mg IVM/ml und 0,36 (± 0,14) mg IVM/ml. Die Untersuchung der Proben mit dem LPT ergab LD50-Werte zwischen 0,11 und 2,31 mg IVM/ml mit einem Median von 0,76 mg IVM/ml. Auch hier konnte mangels eines Schwellenwerts keine Diagnose anhand des in vitro-Tests gestellt werden. Die Ergebnisse der EZRT lassen den Schluss zu, dass bei den hier untersuchten Pferden noch keine IVM-Resistenz aufgetreten ist. Zusammenhänge zwischen dem Auftreten von Betriebsformen, Weide- und Entwurmungsmanagements konnten nicht festgestellt werden. Die Real-time PCR wurde als Mittel zur Resistenzdetektion an adulten Strongyliden und dritten Larven eingesetzt. Anhand dieser Methode konnten die Genotypen hinsichtlich des Codons 200 des β-Tubulin-Gens von 53 Adulten und 102 Larven eindeutig und zuverlässig charakterisiert werden. Die Prävalenz der Allele TTC und TAC in der Larvenpopulation betrugen 66,7 % bzw. 33,3 %. Die Genotypisierung der adulten Würmer waren reproduzierbar und korrelierten mit den Ergebnissen der konventionellen PCR in Untersuchungen. Da die quantitative Untersuchung mittels der Real-time PCR hier nicht durchführbar war ist diese Methode für den Einsatz in der Klinik oder in der Routinediagnostik zum Nachweis von Bezimidazlresistenz nicht geeignet.

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Wirtherle, Nicole Catherine: Untersuchungen zur Verbreitung von Anthelminthikaresistenzen bei Pferden in Niedersachsen. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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