Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Isolation of high affinity peptides for the charaterization of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

Stratmann, Janin

M. avium subspecies paratuberculosis (M. paratuberculosis) is the etiological agent of paratuberculosis resp. Johne's disease, a chronic granulomatous enteritis of ruminants occuring worldwide and leading to growing economic losses. The pathogen is shed intermittently during subclinical infection with feces and milk, with clinical signs developing after a prolonged incubation period of up to five years. To date no diagnostic tests are available that provide a sensitive and rapid diagnostic test system for the detection of M. paratuberculosis in milk. In this study a M. paratuberculosis specific peptide from a phage-peptide display library was isolated, which does not show cross reactivitiy with the closely related M. avium. In combination with magnetic separation technology and subsequent PCR, based on the M. paratuberculosis insertion element ISMav2, the detection of M. paratuberculosis in milk was possible. Peptide-mediated capture PCR facilitated the detection of as few as 10 M. paratuberculosis bacteria per ml in spiked milk samples, and the reproducable detection of M. paratuberculosis in milk samples from infected cows and seropositive herds. As the test is based solely on defined reagents, it might be suiTable for routine testing of pooled milk samples. To date, very little is known about the biology of M. paratuberculosis and the pathogenesis of the disease. A major mechanism in the pathogenesis of paratuberculosis is the intracellular survival of the pathogen in host macrophages. This might be facilitated by a ferric reductase that is excreted by M. paratuberculosis. To further investigate the role of ferric reductase, the attempt was made to isolate recombinant phages specifically binding to the enzyme. But, as this failed with the biopanning protocol chosen it is necessary to alter the biopanning procedure to obtain specific phages allowing an elucidation of the role of ferric reductase in infection. As Mpt, a putative ABC transporter system of M. paratuberculosis, might play a role in pathogenesis, a specific phage directed against the putative mpt transmembrane protein MptD was isolated. It was shown that phage fMptD could detect M. paratuberculosis not only in vitro, but also during infection, as M. paratuberculosis could be detected in infected J774 mouse macrophages as well as in lymph node tissue from an infected cow. Furthermore, it was possible to detect M. paratuberculosis in bulk milk samples via the phage-deduced peptide aMptD, using a peptide-mediated capture PCR. These findings indicate that MptD epitopes are expressed and surface exposed in vitro and in vivo and support the hypothesis that MptD might be a relevant virulence factor. In addition it was demonstrated that peptide aMptD decreases phagocytosis of M. paratuberculosis by J774 mouse macrophages. This finding supports that the Mpt operon might play a role in virulence and present a potential target for novel therapeutic and vaccination strategies.

Mycoabcterium avium suspecies paratuberculosis (M. paratuberculosis) ist der Erreger der Paratuberkulose bzw. Johne‘schen Erkrankung, einer weltweit auftretenden chronisch granulomatösen Enteritis bei Wiederkäuern, die zu bedeutenden wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Erreger wird in der subklinischen Phase der Erkrankung intermittierend mit dem Kot und in der Milch ausgeschieden. Das klinische Bild der Erkrankung zeigt sich aber meist erst nach einer sehr langen Inkubationszeit von bis zu fünf Jahren. Bis heute ist kein diagnostischer Test erhältlich, der eine schnelle und sensitive Diagnose von M. paratuberculosis in Milch ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein M. paratuberculosis spezifisches Peptid aus einer Phagen-Peptid Bibliothek isoliert, das keine Kreuzreaktionen mit dem nahe verwandten M. avium zeigte. Die Kombination dieses Peptids mit paramagnetischen Partikeln zur Anreicherung des Erregers, gefolgt von einem Erregernachweis mittels PCR, basierend auf dem M. paratuberculosis Insertionselement ISMav2, ermöglichte den Nachweis von M. paratuberculosis in Milch. Die peptidvermittelte "capture" PCR ermöglichte neben dem Nachweis von nur 10 Erregern pro Milliliter künstlich kontaminierter Milch auch den reproduzierbaren Erregernachweis in Milchproben von infizierten Kühen und in Sammelmilchproben von serologisch positiven Herden. Da die peptidvermittelte "capture" PCR ausschließlich auf standardisierten Reagenzien basiert, könnte diese für die routinemäßige Untersuchung von Sammelmilchproben eingesetzt werden. Bis heute ist wenig über die Pathogenitätseigenschaften von M. paratuberculosis bekannt, aber einen wichtigen Faktor stellt ohne Zweifel das intrazelluläre Überleben der Erreger in den Makrophagen des Wirtes dar. Dieses könnte unter anderem durch eine Eisenreduktase ermöglicht werden, die von M. paratuberculosis in die Umgebung sezerniert wird. Um die Rolle dieser Eisenreduktase weiter zu untersuchen, wurde der Versuch unternommen, spezifische Phagen für dieses Enzym zu isolieren. Da mittels Biopanning auf der Basis von elektrophoretisch isolierter Eisenreduktase keine spezifischen Phagen isoliert werden konnten, muß das Biopanning verändert werden um das Enzym mittels spezifischer Phagen weiter untersuchen zu können. Eine weitere wichtige Rolle in der Pathogenese könnte das mpt-Operon spielen, ein potentielles ABC-Transporter System, das als spezifisch für M. paratuberculosis beschrieben wurde. Es wurde ein Phage isoliert, der spezifisch an das wahrscheinliche transmembranale Protein MptD des ABC Transporters bindet. Mittels dieses spezifischen Phagen (fMptD) gelang der Nachweis von M. paratuberculosis sowohl in vitro, in infizierten J774 Mausmakrophagen als auch in Gefrierschnitten vom Lymphknoten einer infizierten Kuh. Zusätzlich war über das von fMptD abgeleitete Peptid aMptD ein Nachweis von M. paratuberculosis in Sammelmilchproben mittels "capture" PCR möglich. Zudem konnte die Phagozytoserate von M. paratuberculosis durch Präinkubation mit dem Peptid aMptD in der Zellkultur vermindert werden. Diese Ergebnisse deuten an, dass das mpt-Operon pathogenitätsassoziiert ist und eröffnen potentiell neue Möglichkeiten der Therapie und Impfung.

Quote

Citation style:

Stratmann, Janin: Isolation of high affinity peptides for the charaterization of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export