Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

A representational difference analysis and the identification of a fructose-specific phosphotransferase system of Brachyspira hyodysenteriae

Rothkamp, Anja

Brachyspira (B.) hyodysenteriae is the etiological agent of swine dysentery, a mucohaemorrhagic diarrhea causing significant economic losses. The pathogenesis of SD is still not fully understood. The hypothesis initiating this work was that the B. hyodysenteriae genome, in comparison to the other four Brachyspira species occuring in swine, possesses species-specific genes which might be responsible for its unique pathogenic properties. Based on this hypothesis a Representational Difference Analysis (RDA) was performed using B. hyodysenteriae B204 as 'tester' and the combined DNA from the reference strains of the other four Brachyspira species as 'driver'. Two B. hyodysenteriae-specific DNA fragments designated as BH100 and BH400 were identified; they hybridized to different locations on the genome of type strain B. hyodysenteriae B78T and are present in one copy only. Their species-specificity was confirmed by Southern blot analyses with Brachyspira ssp. reference strains and field isolates. One RDA fragment is part of a 2130 bp ORF designated as bhoA (B. hyodysenteriae orphan protein A). Database search revealed limited homology to sensor transduction kinases of Dictyostelium discoideum. Based on the second RDA fragment a putative fructose-specific phosphotransferase system (PTS) of B. hyodysenteriae was identified consisting of genes encoding a putative transcriptional repressor (fruR), PTS enzymes IIA (fruA) and IIBC (fruBC), and fructose-bisphosphate aldolase (fbaA). Nucleotide sequence analysis reavealed direct repeats between the fruR and fruA genes which might serve as operator, and inverted repeats downstream of the fbaA gene possibly representing intrinsic transcriptional terminators. Western blot and Northern blot analyses revealed a fructose-induced upregulation of transcription and translation of the PTS genes fruA and fruBC, respectively, and a constitutive transcription and translation of the fruR gene. In addition, Northern blot analysis revealed several transcripts reacting with a fruBC-derived probe indicating a posttranscriptional processing of the polycistronic mRNA. In combination with the result of a primer extension analysis a negative regulation of the B. hyodysenteriae-specific PTS with posttranscriptional cleavage of the mRNA is proposed. A chemotaxis assay revealed chemotaxis of B. hyodysenteriae towards fructose. As PTSs are involved in positive chemotaxis towards carbohydrates, the fructose-specific PTS identified in B. hyodysenteriae might play a role in chemotaxis towards fructose; a potential role in pathogenesis of SD remains to be investigated.

Brachyspira (B.) hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie, einer mukohaemorrhagischen Diarrhoe, die wirtschaftlich bedeutsame Verluste verursacht. Die Pathogenese der Schweinedysenterie ist nicht vollständig geklärt. Die dieser Arbeit zugrunde liegende Hypothese war, dass das Genom von B. hyodysenteriae, im Vergleich zu denen der vier weiteren Brachyspira Spezies im Schwein, Gene besitzt, die für die spezifischen pathogenen Eigenschaften von B. hyodysenteriae verantwortlich sein könnten. Basierend auf dieser Hypothese wurde eine Repräsentative Differenzanalyse (RDA) mit B. hyodysenteriae B204 als 'Tester' und der gepoolten DNA der Referenzstämme der anderen vier Brachyspira Spezies als 'Driver' durchgeführt. Zwei B. hyodysenteriae-spezifische DNA-Fragmente, BH100 und BH400, wurden identifiziert; beide Fragmente hybridisieren an unterschiedlichen Lokalisationen des Genoms von Typstamm B. hyodysenteriae B78T und liegen in je einer Kopie vor. Die Spezies-Spezifität wurde durch Southern Blot Analysen an Referenzstämmen und Feldisolaten aller vier Brachyspira Spezies bestätigt. Das erste RDA-Fragment liegt in einem 2130 bp langen ORF, der als bhoA (B. hyodysenteriae orphan Protein A) benannt wurde. Datenbanksuchen ergaben nur eine geringe Homologie zu Signaltransduktions-Kinasen von Dictyostelium discoideum. Ausgehend von dem zweiten RDA-Fragment wurde ein potentielles Fruktose-spezifisches Phosphotransferase-System (PTS) von B. hyodysenteriae identifiziert, bestehend aus den Genen für einen Transkriptionsrepressor (fruR), ein PTS Enzym IIA (fruA), ein Enzym IIBC (fruBC) und einer Fruktosebiphosphat Aldolase (fbaA). Die Analyse der DNA-Sequenz zeigte eine direkte Wiederholungssequenz zwischen den fruR- und fruA–Genen, die möglicherweise als Operator fungiert, und invertierte Wiederholungssequenzen stromabwärts vom fbaA-Gen, die als intrinsische Transkriptions-Terminatoren dienen könnten. Western Blot- und Northern Blot-Analysen zeigten eine Fruktose-induzierte Hochregulation der Transkription und Translation der PTS-Gene fruA und fruBC und eine konstitutive Transkription und Translation des fruR-Gens. Zusätzlich zeigte die Northern Blot-Analyse mehrere Transkripte, die mit einer fruBC-Sonde reagierten, was eine posttranskriptionale Prozessierung der polycistronischen mRNA vermuten läßt. In Kombination mit dem Ergebnis einer "primer extension" Analyse wird eine negative Regulierung des B. hyodysenteriae-spezifischen PTS mit posttranskriptionaler Spaltung der mRNA postuliert. Ein Chemotaxis-Versuch zeigte Chemotaxis von B. hyodysenteriae zu Fruktose. Da Phosphotransferase-Systeme positive Chemotaxis zu Kohlenhydraten vermitteln, könnte das hier identifizierte Fruktose-spezifische PTS von B. hyodysenteriae eine Rolle spielen bei der Chemotaxis zu Fruktose; die potentielle Rolle in der Pathogenese der Schweinedysenterie bleibt zu klären.  

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Rothkamp, Anja: A representational difference analysis and the identification of a fructose-specific phosphotransferase system of Brachyspira hyodysenteriae. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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