Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ausgewählter Antibiotika und Chemotherapeutika in Hühnereiern mittels mikrobiologischem Hemmstofftest

Bendix, Annette

Aim of this thesis was to develop a new method to detect several antibacterial substances in eggs sensitive by low costs and short time needed. The choose of antibiotics (Oxytetracyclin, Doxycyclin, Ampicillin, Sulfadimidin, Dihydrostreptomycin, Colistin, Enrofloxacin) orientated by the use in the therapy of laying hens. Drug-free egg was endowed with different concentrations of antibiotics and than cleaned-up after deproteination by solid-phase extractions. For the extraction were used a cationic column, a C18-column and a combination of columns. The detection was made by using a microbiological assay. Besides the detection by the German three-plate test we used microbiological assays of Bacillus stearothermophilus var. calidolactis and E. coli. The microbiological assay could detect the examined antibacterial substances. Did we take Bac. stearothermophilus var. calidolactis and E. coli in addition to the German Bacillus subtilis BGA test , the microbiological assay could be used as a sensitive screening test for the detection of several antibacterial residues. The solid-phase extraction allowed the clean-up of the deproteiniziated egg. The C18-column was suitable for the clean-up of Ampicillin, Oxytetracyclin, Doxycyclin and Sulfadimidin. The best recovery showed the cationic-column for the clean-up of Enrofloxacin and Colistin. The combination of solid-phase extraction and the extended microbiological assay made it possible to detect the examined antibacterial substances in eggs. The detection limits of the substances were very different. It was possible to detect Ampicillin up to 0,4 µg/kg egg by using a combination of C18-column and Bac. stearothermophilus var. calidolactis. By using the C18-column in combination with Bacillus subtilis pH 6,0 it was possible to detect the tetracyclines. Oxytetracyclin showed a detection limit of 82 µg/kg egg; the detection limit of Doxycyclin was 13 µg/kg egg. For the detection of Sulfadimidin we used the C18-column in combination with Bacillus subtilis pH 7,2 with the addition of Trimethoprim because of chemical incompatililties of the deproteination. The calculated detection limit was 530 µg/kg egg with a recovery of 50 %. The combination of the SA-column with Bacillus stearothermophilus var. calidolactis showed a detection limit of 800 µg/kg egg. By using a combination of SA-column with E. coli pH 7,2 with addition of Trimethoprim we cdetected Enrofloxacin in concentrations of 30 µg/kg egg. Dihydrostreptomycin was not further examined in the main experiment because the recoveries of the solid-phase extractiones were below 20 % for all tested columns.

Auf Grund des immer stärker werdenden finanziellen Druckes auf den Halter von Legehennen ist der prophylaktische und therapeutische Einsatz von antibakteriell wirksamen Arzneimitteln unumgänglich. Diese Behandlungen bedingen aber ein mögliches gesundheitliches Risiko für den Verbraucher beim Konsum von Hühnereiern. Um dieser Gefahr zu begegnen, ist eine engmaschige Überprüfung einer großen Anzahl an Eiern notwendig, welche nur mit praktikablen, sensitiven Methoden umsetzbar ist. Zur Zeit entfallen lediglich 0,4% aller Untersuchungen des nationalen Rückstandskontrollplanes auf antibakterielle Rückstände in Hühnereiern (BVL, 2003), welches sicherlich einerseits in den hohen Kosten begründet ist und andererseits durch fehlende rechtliche Reglementierungen bedingt wird. Die in der amtlichen Überwachung weit verbreitete HPLC als selektive und sensitive Nachweismethode für antibakterielle Hemmstoffe in Eiern ist außerdem in der Routineuntersuchung auf der Ebene der betrieblichen Eigenkontrollen auf Grund hoher Kosten, hohem Zeit- und Materialaufwand für Untersuchungen in höherer Anzahl wenig praktikabel. Es soll daher das Ziel dieser Arbeit sein, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe große Eiprobenzahlen sicher auf antibakterielle Hemmstoffe untersucht werden können, ohne dadurch die amtliche oder betriebliche Überwachung mit erheblichen Mehrkosten zu belasten. Neben der HPLC wird als klassisches Nachweissystem auf antibakterielle Rückstände der Agardiffusionstest als sogenannter Dreiplattentest eingesetzt, welcher nur einen geringen labortechnischen Aufwand erfordert und damit die Möglichkeit zur Durchführung von Reihenuntersuchungen (KUNDRAT, 1972; BOTSOGLOU et al., 2001) bietet. Positive Befunde können nur einen Hinweis auf die vorhandene Antibiotikaklasse in der Probe geben und müssen gegebenenfalls durch andere Methoden verifiziert werden (STUMPF, 1993). Die bereits von PASTOORS 1988 untersuchte Möglichkeit der qualitativen Eingrenzung antimikrobieller Rückstände durch den Einsatz verschiedener Testkeime wurde in dieser Arbeit aufgegriffen, um verschiedene Antibiotikaklassen, welche in der Geflügelpraxis eine Rolle spielen (Ampicillin, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Dihydrostreptomycin, Sulfadimidin, Colistin und Enrofloxacin), sensitiv und selektiv nachzuweisen. Dabei wurden als Testkeime neben Bacillus subtilis BGA auf Nährböden mit drei verschiedenen pH-Werten, Bacillus stearothermophilus var. calidolactis und ein E.coli-Stamm getestet. Zusätzlich wurde der mikrobiologische Hemmstofftest mit geeigneten Festphasenextraktionen gekoppelt, um die Nachweisgrenze so sensitiv wie möglich zu gestalten. Antibiotikafreie Volleiproben wurden mit verschiedenen Antibiotikakonzentrationen dotiert und diese nach Enteiweißung mittels Festphasenextraktionen aufgereinigt. Zur Extraktion wurden eine Kationenaustauschersäule, eine C18-Säule und eine Kombinationssäule verwendet. Der Nachweis erfolgte im mikrobiologischen Hemmstofftest, wobei neben den in der amtlichen Fleischuntersuchung vorgeschriebenen Testsystemen außerdem noch Kulturen von Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli auf ihre Eignung zum Nachweis getestet wurden. Der mikrobiologische Hemmstofftest war geeignet, die untersuchten Substanzen nachzuweisen. Werden neben dem klassischen Dreiplattentest mit Bac. subtilis auf Standardnährböden zusätzlich Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli eingesetzt, so kann der mikrobiologische Hemmstofftest als sensitives Screening-Verfahren zum Nachweis von einzelnen Antibiotikarückständen genutzt werden. Eine vorgeschaltete Festphasenextraktion ermöglichte das Aufreinigung des enteiweißten Volleies, wobei die C18-Säule zur Aufreinigung von Ampicillin, Oxytetracyclin, Doxycyclin und Sulfadimidin am geeignesten war. Für Enrofloxacin und Colistin zeigte die Kationenaustauschersäule die beste Wiederfindung. Kombinierte man die Festphasenextraktion mit dem erweiterten Hemmstofftest, so war ein Nachweis der untersuchten Substanzen in Vollei möglich. Die dabei ermittelten Nachweisgrenzen der einzelnen Substanzen unterscheiden sich hierbei erheblich. Für den Nachweis von Ampicillin ließ sich eine Nachweisgrenze von 0,4 µg/kg Ei durch Kombination der C18-Säule mit einer Kultur von Bac. stearothermophilus var. calidolactis ermitteln. Bei Verwendung der C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus subtilis pH 6,0 war es möglich, die Tetracycline selektiv nachzuweisen. Für Oxytetracyclin ergab sich dabei rechnerisch eine Nachweisgrenze von 82 µg/kg Vollei, für Doxycyclin 13 µg/kg Vollei. Für Sulfadimidin hat sich auf Grund chemischer Unverträglichkeiten der Enteiweißung die C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus subtilis pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz als am sensitivsten erwiesen. Die errechnete Nachweisgrenze lag für diese Substanz bei 530 µg/kg Vollei bei einer mittleren Wiederfindung von etwa 50 %. Die Kombination der SA-Säule mit der Kultur von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis auf Isoagar erbrachte für Colistin eine Nachweisgrenze von etwa 800 µg/kg Vollei. Kombiniert man die SA-Säule mit der Kultur von E. coli pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz, so kann man Enrofloxacin in Konzentrationen von 30 µg/kg Vollei sicher nachweisen. Dihydrostreptomycin wurde im Haupversuch nicht weiteruntersucht, da die Wiederfindungsraten der Säulentestung für alle Säulen unter 20 % lag.

Quote

Citation style:

Bendix, Annette: Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ausgewählter Antibiotika und Chemotherapeutika in Hühnereiern mittels mikrobiologischem Hemmstofftest. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export