Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion

Bohrßen, Antje

An effective treatment of tuberculosis requires a rapid detection and identification of the causative agent. Because of the slow growth rate of mycobacteria culture-based isolation and identification can take several weeks. The use of real-time PCR in clinical diagnostic procedures allows an amplification followed by hybridisation within one hour. In the present study using LightCycler technology, identification and differentiation of tuberculous and non-tuberculous mycobacteria from clinical specimens grown in culture was achieved by targeting the 16S rRNA-gene. At present, it is the fastes available method for identification of mycobacteria. An improved inhibition control allowed the distinction between negative and because of inhibitors not amplified samples. By using two further hybridization probes the most frequently isolated species besides the M. tuberculosis-complex (TBC), M. avium and M. chelonae-abscessus-complex were identified in a second reaction. Therefore the time-consuming and expensive sequencing could be avoided in approximately 80% of culture positive specimens. M. avium appeared to be the most prevalent species in specimens from HIV-positive patients. M. chelonae-abscessus-complex was most frequently detected in specimens from patients suffering from cystic fibrosis Furthermore we evaluated differentiation of tuberculous and non-tuberculous mycobacteria in clinical respiratory specimens without antecedent culture. The lower limit of detection was 100 mycobacteria/ml sputum. Specificity was 100% for all tests. Sensitivity was 66.7% for specimens regardless of smear result. A sensitivity of 88.9% and 100% respectively, was achieved for smear positive samples. These results suggest, that only smear positive specimens should be subjected to molecular analysis using PCR. Finally a method was developed to replace phenotypic differentiation of the TBC with a molecular technique. A single nucleotide polymorphism in narGHJI was specific for M. tuberculosis. In medical microbiology more than 90% of TBC isolates from human specimens are typically M. tuberculosis, which can now be diagnosed without further phenotyping. For further differentiations within the TBC we included the analysis of M. bovis and M. bovis BCG. Based on these results, a rapid and unambiguous diagnosis of M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG from culture positive specimens was possible.

Eine effektive Bekämpfung der Tuberkulose erfordert eine schnelle Detektion und Identifikation des Erregers. Aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien kann die Isolation und Identifizierung aus der Kultur, die als "Goldstandard" betrachtet wird, mehrere Wochen dauern. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im real-time Modus ermöglicht in der klinischen Diagnostik eine Amplifikation und anschließende Sondenhybridisierung von DNA in einer Stunde. Mit dem in dieser Arbeit etablierten LightCycler-Test kann der spezifische Nachweis von Mykobakterien und gleichzeitig die Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien auf der Grundlage des 16S rRNA-Gens innerhalb einer Stunde aus positiven Kulturisolaten von respiratorischen und nichtrespiratorischen Patientenmaterialien gestellt werden. Zur Zeit gibt es kein schnelleres Nachweisverfahren für Mykobakterien. Durch eine optimierte Inhibitionskontrolle lassen sich negative Proben von aufgrund von Inhibitoren nicht amplifizierten Proben unterscheiden. Durch den Einsatz von zwei weiteren Sonden zur Differenzierung von nichttuberkulösen Mykobakterien konnten die am Institut für Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) neben dem M. tuberculosis-Komplex (TBC) am häufigsten isolierten Spezies, M. avium und der M. chelonae-abscessus-Komplex, in einer zweiten Reaktion identifiziert werden. Damit kann in etwa 80% der Fälle auf die bisher durchgeführte zeitaufwendige und kostenintensive Sequenzierung von positiven Kulturisolaten verzichtet werden und diese durch die neue beschriebene Methode ersetzt werden. Die bei HIV-Patienten in der Studie der MHH am häufigsten isolierte Spezies war M. avium, bei den mit Cystischer Fibrose (CF) erkrankten Patienten der M. chelonae-abscessus-Komplex. Um eine Diagnose und Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien direkt aus respiratorischem Patientenmaterial zu ermöglichen, wurde eine Präparationsmethode getestet, die die Detektion von Mykobakterien-DNA mit dem beschriebenen PCR-Format ermöglicht. Der Nachweis von 100 Mykobakterien pro Milliliter Sputum war mit der anschließenden Amplifikation und Detektion möglich. Bei der Überprüfung des Direktnachweises auf die Spezifität und Sensitivität anhand von respiratorischen Patientenproben wurde eine Spezifität von 100% erreicht. Die Sensitivität betrug 66,7%, unabhängig davon, ob im Direktausstrich säurefeste Stäbchen zu sehen waren. Bei Proben die im Direktausstrich positiv waren, konnte die Sensitivität auf 88,9% und 100% gesteigert werden. Das bedeutet, dass insbesondere Proben, die im Direktausstrich säurefeste Stäbchen zeigen, für den Nachweis aus Direktmaterial geeignet sind. Da allerdings nur eine geringe Anzahl an Proben getestet wurde, muss eine endgültige Aussage hinsichtlich Spezifität und Sensitivität anhand einer prospektiven Studie gemacht werden. Schließlich konnte in dieser Arbeit die weit verbreitete phänotypische Unterscheidung zwischen M. tuberculosis und den anderen Mitgliedern des TBC mit Hilfe der Nitratreduktaseaktivität durch einen neuen molekularen Test ersetzt werden. Der T/C-Polymorphismus im Promotorbereich von narGHJI war spezifisch für M. tuberculosis. Damit ist ein spezifischer molekularer Nachweis für M. tuberculosis möglich. In der humanen Mykobakteriendiagnostik sind weit über 90% der TBC-Isolate M. tuberculosis, die nun eindeutig ohne weitere Phänotypisierung identifiziert werden können. Für die weitere Differenzierung innerhalb des TBC wurde außerdem der Nachweis von M. bovis und M. bovis BCG mit zwei weiteren Sonden geführt. Basierend auf diesen eigenen Ergebnissen war es möglich, M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG eindeutig aus kulturellen Isolaten zu identifizieren.

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Bohrßen, Antje: Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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