Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2) und der BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratte als Modelle für Taubblindheit des Menschen (USH1) bzw. Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion

Chwalisz, Wojciech

Both, the LEW/Ztm-ci2 and theBH.7A/Ztm-ci3 rat, carry spontaneous mutations, which causelateralized circling behavior and locomotor hyperactivity. The ci2 phenotype is alsocharacterized by ataxia and opisthotonus. Previous studieshave shown a neurochemical lateralization within the dopaminergic system of thebasal ganglia in both rats and a morphological lateralization of dopaminergicneurons in the BH.7A/Ztm-ci3 rat. In addition, functional and histologicalanalyses of the inner ear of the LEW/Ztm-ci2 rat revealed degenerationsconcerning the hair cells of the cochlea and the vestibular apparatus leadingto profound deafness and vestibular dysfunction. Using breedingexperiments it was shown that both mutations are gentically transmitted asautosomal recessive traits. Furthermore, a classical complementation analysis(cis-trans test) clearly indicated that both circling mutations affectdifferent loci. In this studygenetic analyses were performed in order to identify the chromosomallocalization bearing the ci2 and the ci3 mutation and to presentfunctional candidate genes. Using anonymous microsatellite markers twobackcross populations ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2; (BN/Ztm xBH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3)) were analyzed, which werepreviously phenotyped by behavioral testing. The incidence of circling behaviorin both populations was nearly 50 %, indicating that the ci2 as well as the ci3phenotypeare caused by a defect in a single locus. These linkage analyses mapped the ci2 mutation to ratchromosome 10 (RNO10) and the ci3 mutation to RNO11. A gene-linkedmarker for Myo15 was designed and the position of this gene in the ratgenome described for the first time within the non-recombinant interval of thecore region of association on RNO10. Thus Myo15, which codes for anunconventional myosin (Myosin XV) that is expressed in the hair cells of theinner ear, can be regarded as a candidate gene for the ci2 phenotype. This isbased on the fact, that  mutationsin the homologue genes of human and mouse are known to cause profound deafnessand vestibular dysfunction due to sensorineural degenerations of the inner ear.Further on, mutations in human MYO7A, a gene that encodes for amyosin with significant structural similarities to Myosin XV, are known tocause “Usher Syndrome” 1B, which is characterized bysensorineural hearing loss, vestibular dysfunction and a progressive retinaldegeneration. Becauseof the hind, that a mutation in a gene encoding for an unconventional myosin mightbe responsible for the ci2 phenotype, GOCKELN et al. (2003) performedfunctional and histological analysis of the retina of LEW/Ztm-ci2 rats. Thisanalysis revealed that LEW-ci2 rats display a progressive retinopathy asdescribed for the “Usher Syndrome” in Human. In this study behavioral testingof the (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 backcrosspopulation indicated that affected individuals of this backcross also display aloss of retinal function. A physical map ofthe non-recombinant interval on RNO10 was generated, which describes theposition of Kcnj12 to this part of the rat genome. This gene, whichcodes for an inwardly rectifying potassium channel, can also be regarded as acandidate gene for the deafblind LEW/Ztm-ci2 rat as these types ofchannels are known to play an important role for the physiology of both theretina and the inner ear. The „UCSC GenomeBioinformatics“ database describes the chromosomal position of Drd3 within the coreregion of association with the ci3 phenotype on RNO11. Thisgene codes for the dopamine D3 receptor and can be regarded as a functionalcandidate for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat, which seems to berelated to a lateralization of the dopaminergic system of the basal ganglia.PCR-amplification of the seven exons of Drd3 was performed in this studyusing genomic DNA of a BH.7A/Ztm-ci3 rat and a rat from thebackround strain. No differences in the length of the PCR-products could be detectedindicating that this gene is not affected by deletions. This result does notexclude that a single point mutation within the sequence of Drd3 might beresponsible for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat. 

Die LEW/Ztm-ci2 undBH.7A/Ztm-ci3 Ratten repräsentierenzwei Mutanten, die sich durch spontanes und lateralisiertes Rotationsverhaltensowie Hyperaktivität und, im Falle der LEW/Ztm-ci2, durch Ataxie und einen Opisthotonus auszeichnen. Durch langjährige Untersuchungen zu den Phänotypen beiderMutanten konnte eine neurochemische Lateralität des dopaminergen Systems derBasalganglien festgestellt werden, wobei BH.7A/Ztm-ci3 Ratten zusätzlich auch eine morphologischeLateralität hinsichtlich dopaminerger Neurone in diesen Strukturen des Gehirnsaufweisen. Analysen zur Funktion und Morphologie des Innenohres zeigten,dass bei der LEW/Ztm-ci2 RatteDegenerationen vom neurosensorischen Typ vorliegen, die sowohl die Haarzellender Cochlea, als auch des vestibulären Systems betreffen und mit entsprechendenFunktionsausfällen verbunden sind. Die beiden Rattenmutanten zu Grunde liegende Genetik wurde mitHilfe klassischer Kreuzungsmethoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dassbeide Mutationen autosomal rezessiv vererbt werden und  es sich um Mutationen handeln muss, dieunterschiedliche Gene betreffen (Komplementationsanalyse). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Fragenachgegangen, in welchen chromosomalen Bereichen beide Mutationen lokalisiertsind und welche Gene sie betreffen könnten. Hierzu dienten zwei segregierendeRückkreuzungspopulationen ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2;(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3), deren Individuen mit Hilfe neurophysiologischerVerhaltensuntersuchungen phänotypisch charakterisiert wurden, um sie in homozygoteund heterozygote Merkmalsträger differenzieren zu können. Untersucht wurde dasRotationsverhalten der Individuen beider Rückkreuzungen sowie die Funktion desauditiven und vestibulären Systems der Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation. Aufgrund dieser Parameter(Rotationsverhalten bzw. Rotationsverhalten und Ausfälle des akustischen undvestibulären Systems) konnte für den ci2- und den ci3-Phänotypeneine Inzidenz von nahezu 50 % in der jeweiligen N2-Populationen festgestelltwerden.    Beide Populationen wurden einer Kopplungsanalyseunter Verwendung anonymer Mikrosatellitenmarker unterzogen, um die Assoziationbeider Phänotypen mit bestimmten chromosomalen Bereichen zu ermitteln. Hierbeizeigte sich, dass sämtliche untersuchte Marker auf Chromosom 10 der Ratte(RNO10) eine signifikante Kopplung zur ci2-Mutation aufwiesen, während sämtliche untersuchten RNO11-Marker einesignifikante Kopplung zur ci3-Mutationzeigten. Mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten,gengekoppelten Mikrosatellitenmarkers konnte erstmalig die Position des Gens Myo15 im Genom der Ratte innerhalb der nicht rekombinantenSuszeptibilitätsregion auf RNO10 bestimmt werden. Myo15, welches für ein unkonventionelles Myosin kodiert, wirdals mögliches Kandidatengen für die LEW-ci2 Mutante betrachtet. Dies ergibt sich daraus,dass  bereits Mutationen in diesemGen beschrieben sind, die zum einen bei betroffenen Menschen und zum anderenbei Mäusen zu neurosensorischen Innenohrdegenerationen und entsprechendenFunktionsausfällen führen. Basierend auf Befunden zu MYO7A (Myosin VIIa) bei Mensch  und Maus (Myo7a)erfolgten durch GOCKELN et al. (2003) Untersuchungen zur Funktion undMorphologie der Netzhaut von LEW/Ztm-ci2 Ratten. Hierbei wurde festgestellt, dass bei den LEW-ci2 Ratten, wie beim „Usher Syndrom“ des Menschen, eineretinale Degeneration in Form einer Retinitis pigmentosa vorliegt. Durch neurophysiologischeVerhaltensuntersuchungen konnten Hinweise erlangt werden, dass entsprechendeRückkreuzungsindividuen auch eine Störung des visuellen Systems aufweisen. Mit Hilfe einer physikalischen Karte der nichtrekombinanten RNO10-Region konnte ebenfalls die Position des Kcnj12 Gens bestimmt werden. Dieses Gen kodiert für einenKaliumeinzelkanal. Es wird auch als Kandidatengen für den ci2-Phänotypen betrachtet, da Kaliumeinzelkanäle sowohlfür die Funktion der Netzhaut, als auch des Innenohres essentiell sind. Innerhalb der zentralen Assoziationsregion mit demci3-Phänotypen auf RNO11 ist lautder Datenbank „UCSC Genome Bioinformatics“ das Gen Drd3 lokalisiert, das für den Dopamin D3-Rezeptorkodiert. Somit ist Drd3 einpotentielles Kandidatengen für den ci3-Phänotypen, dem nach bisherigen Erkenntnisstand eine morphologische undneurochemische Lateralität des dopaminergen Systems zu Grunde liegt. Im Rahmender vorliegenden Arbeit wurden die sieben Exone dieses Gens unter Verwendunggenomischer DNA einer BH.7A/Ztm-ci3Ratte sowie jeweils einer Ratte des congenen Stamms BH.7A/Ztm-ci3 und des originären Hintergrundes BH/Ztm mittels PCRamplifiziert. Hierbei wurden aber keine Längenunterschiede der PCR-Produktefestgestellt, die auf mögliche größere Deletionen innerhalb dieses Genshinweisen würden. Allerdings konnten bisher Punktmutationen in Drd3, die für den ci3-Phänotyp verantwortlich sind, nicht ausgeschlossen werden.

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Chwalisz, Wojciech: Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2) und der BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratte als Modelle für Taubblindheit des Menschen (USH1) bzw. Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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