Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Der Einfluss von Wärme auf die Strahlenempfindlichkeit und die Reparatur strahleninduzierter Doppelstrangbrüche in HeLa-Zellen in Abhängigkeit vom Zellzyklus

Duen, Diana

The aim of this study was to investigate the molecular mechanisms underlying thermal radiosensisation in dependence of cell cycle position. The experiments were performed with the human tumor cell line HeLa. Cells synchronised in G1 and S-phase were exposed to X-rays alone or in combination with prior heating at 44°C for 20 min. Cell kill was determined by means of colony forming assay, double-strand breaks using constant-field gel electrophoreses (CFGE) and apoptotic cell death was scored using the fraction of detached cells. For the experiments the cells were synchronised either in G1- or S-phase. The synchronisation in the G1-phase was achieved by confluent growth of cell cultures leading to an accumulation of up to 70% of cells in the G1-phase. The synchronisation in the S-phase was obtained in a stepwise procedure. Cells grown to confluence were restimulated and arrested at the G1/S border by the addition of Aphidicolin. Release from block resulted into a synchronous proliferation with an accumulation of up to 80% in the S-phase. After irradiation alone G1-phase-cells showed a slightly higher cellular radiosensitivity than S-phase-cells. Prior heating at 44°C for 20 minutes resulted into an increased radiosensitivity which was moderate for G1-cells (thermal enhancement factor, TER=1.2) but pronounced for S-phase-cells (TER=2.0). Detection of DNA-double-strand breaks in G1- and S-phase-cells using CFGE showed substantial differences. For the same dose the fraction of DNA migrating into the gel was clearly lower in S-phase-cells when compared to G1-phase-cells. This reduction was attributed to a hindrance of the DNA migration in S-phase cells due to the complex structure of DNA replication forks. Prior heating at 44°C was found to have no effect on the induction but substantially to alter the repair of DNA double-strand breaks. For both cell cycle phases kinetics of dsb repair was found to be described by biphasic kinetics. The kinetics of the fast phase was almost identical for the two phases, whereas the kinetics of the second, slow phase During the first fast phase showed no difference, the second slow phase demonstrated that S-phase-cells were smaller in repair than G1-.phase-cells.The double-strand break was only slightly obstructed by a heating up with 44°C in to the G1.phase-cells, while for S-phase-cells a clear impairment was observed. For the number of slowly repairing double-strand breaks, as it was measured 360 minutes after irradiation, an increase resulted around the factor TER=1,7 for G1-phase-cells, on the other hand for S-phase-cells by TER= 3,4. This clear increase the S-phase-cells was attributed to the fact that additionaly double-strand breaks developed after a combined treatment. Altogether the results showed that the dependence of the thermo-ray-sensitivity on the cell-cycle and above all the pronounced sensitivity of the S-phase-cells with the effect of warmth on the DNA-double-strand breaks repair and in particular the clear increase in the number of the slowly repairing double-strand breaks are to be explained there.

Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die zur Abhängigkeit der Thermostrahlensensibilisierung vom Zellzyklus führen. Diese Untersuchungen wurden mit der humanen Tumorlinie HeLa durchgeführt. Die Zellen wurden bestrahlt oder einer kombinierten Behandlung mit einer vorangehenden Erwärmung bei 44°C für 20 min ausgesetzt und das Zellüberleben mit Hilfe des Kolonietests und die Anzahl der Doppelstrangbrüche mit Hilfe der Konstantfeld-Gelelektrophorese bestimmt. Für die Versuche wurden die Zellen zum einen in der G1-Phase und zum anderen in der S-Phase synchronisiert. Die Synchronisation in der G1-Phase erfolgte durch das Wachstum in die Konfluenz, wodurch bis zu 70% der Zellen in der G1-Phase angereichert werden konnten. Die Synchronisation in der S-Phase erfolgte in mehreren Schritten, wobei restimulierte Zellen zunächst mit Hilfe Aphidicolin an der G1/S-Grenze angehalten wurden. Durch Aufheben des Blocks konnte ein synchrones Einwandern in die S-Phase erreicht werden mit einer Anreicherung von mehr als 80% der Zellen in der späten S-Phase. Nach Bestrahlung allein zeigten G1-Phasezellen eine geringfügig größere Empfindlichkeit als S-Phasezellen. Eine vorangehende Erwärmung bei 44°C für 20 min bewirkte vor allem eine Zunahme der Strahlenempfindlichkeit von S-Phasezellen (TER=2,0), während für G1-Phasezellen nur eine geringe Steigerung beobachtet wurde (TER=1,2). Hinsichtlich des Nachweises von DNA-Doppelstrangbrüchen wurden für G1- und S-Phasezellen große Unterschiede beobachtet. Bei einer bestimmten Dosis war der Anteil der aus den Zellkernen herausgewanderten DNA in S-Phasezellen deutlich geringer als in den G1-Phasezellen. Dieses verminderte Herauswandern konnte auf die in Folge der Replikation komplexen DNA-Strukturen zurückgeführt werden. Es wurde gefunden, dass Wärme keinen Einfluss auf die Erzeugung, wohl aber auf die Reparatur strahleninduzierter Doppelstrangbrüche hat. Nach Bestrahlung mit 40 Gy allein wurde für beide Zellzyklusphasen eine biphasige Kinetik gefunden. Während sich für die erste, schnelle Phase kein Unterschied ergab, zeigte sich für die zweite, langsame Phase in S-Phasezellen eine etwas geringere Reparatur als für G1-Phasezellen. Durch eine Erwärmung bei 44°C wurde die Doppelstrangbruchreparatur in den G1-Phasezellen nur geringfügig behindert, während für S-Phasezellen eine deutliche Beeinträchtigung beobachtet wurde. Für die Zahl der langsam reparierten Doppelstrangbrüche, wie sie 360 min nach Bestrahlung gemessen wurde, ergab sich für G1-Phasezellen eine Zunahme um den Faktor TER=1,7, dagegen für S-Phasezellen von TER=3,4. Diese deutliche Zunahme in den S-Phasezellen wurde auf die Entstehung zusätzlicher Doppelstrangbrüche nach kombinierter Behandlung zurückgeführt. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Abhängigkeit der Thermostrahlen­sensibilisierung vom Zellzyklus und da vor allem die ausgeprägte Sensibilisierung der S-Phasezellen mit der Wirkung von Wärme auf die DNA-Doppelstrangbruchreparatur und insbesondere der deutlichen Zunahme in der Zahl der langsam reparierten Doppelstrangbrüche zu erklären ist.

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Duen, Diana: Der Einfluss von Wärme auf die Strahlenempfindlichkeit und die Reparatur strahleninduzierter Doppelstrangbrüche in HeLa-Zellen in Abhängigkeit vom Zellzyklus. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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