Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen Synzytialvirus mit Hilfe rekombinanter Sendai-Viren

Hinz, Matthias

Respiratory syncytial virus (RSV) is a Pneumovirus belonging to the family Paramyxoviridae. It is the major cause of lower respiratory tract disease in infants and calves. There is no licensed vaccine available for the human variant. The fusion protein (F) is one of three surface glycoproteins of RSV. It induces neutralizing antibodies in the host organism. Furthermore it is able to bind to heparan sulfate structures and mediates fusion of the viral membrane with the plasma membrane of the target cell. Like in all other paramyxoviruses, the inactive precursor fusion protein has to be cleaved into the F1 and F2 subunits to acquire fusion activity. Multibasic motifs between F1 and F2 allow cleavage by the ubiquitous protease furin in the trans-Golgi-network. An RSV deletion mutant containing F as the only surface protein can infect cells. In order to analyze this viral surface protein in more detail two recombinant Sendai viruses (rSeV) were generated. One virus (rSeV-RSV-Fnat) allowed the expression of native RSV-F protein, another one (rSeV-RSV-Fch) the expression of a chimeric fusion protein in which the cytoplasmic tail and the membrane anchor were replaced by the corresponding portions of the SeV fusion protein. For comparison, a recombinant Sendai virus was used, that contained the gene for the red fluorescent protein (DsRed) in place of the chimeric fusion protein (rSeV-DsRed). This control virus required the addition of exogenous trypsin for the formation of infectious virions, because SeV-F protein contains a single arginine at the cleavage site rather than a multibasic amino acid motif. As expected, rSeV-DsRed grew in cell culture only in the presence of trypsin. rSeV-RSV-Fch did not require the addition of exogenous proteases for growth in cells and, therefore, was independent of the SeV-F protein. This result demonstrates that the ectodomain of the RSV fusion protein can mediate a SeV infection. The native RSV fusion protein was incorporated into Sendai virions like the chimeric fusion protein, but was not able to mediate an infection. The SeV-F portions in the chimeric construct appear to be important for the entry process maybe by interacting with other SeV proteins. Pretreatment with neuraminidase rendered cells resistant to infection by rSeV-RSV-Fch. Evidently rSeV-RSV-Fch depends on the ability of the HN protein of SeV to attach to sialic acid containing receptors on the cell surface. Therefore, the F protein of RSV can mediate fusion, but not attachment in the context of a SeV infection. This conclusion is supported by the finding that the infection by rSeV-RSV-Fch is prevented both by anti-RSV-F antibodies and anti-SeV antibodies. rSeV-RSV-Fch is an interesting tool to analyze the immune response elicited by the RSV-F protein. The results presented here help to understand the characteristics of the RSV fusion protein and can be important for improving viral vector systems for gene therapy and vaccination.

Das respiratorische Synzytialvirus (RSV) ist ein Pneumovirus und gehört zur Familie Paramyxoviridae. Es ist der wichtigste virale Erreger von Infektionen des unteren Respirationstraktes bei Kindern und Kälbern. Für die humane Variante von RSV gibt es keinen zugelassenen Impfstoff. Das Fusionsprotein (F) ist eines von drei Oberflächen-Glykoproteinen bei RSV. Es induziert die Bildung neutralisierender Antikörper im Wirtsorganismus. Darüber hinaus ist es in der Lage, an Heparansulfat-haltige Strukturen zu binden und vermittelt die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Wirtszelle. Wie bei allen anderen Paramyxoviren, muss das inaktive Vorläufer-Fusionsprotein in die Untereinheiten F1 und F2 gespalten werden, um Fusionsaktivität zu erlangen. Multibasische Motive zwischen F1 und F2 ermöglichen die Spaltung durch die ubiquitäre Protease Furin im Trans-Golgi-Netzwerk. Eine Deletionsmutante von RSV, die das Fusionsprotein als alleiniges Oberflächenprotein besitzt, ist in der Lage, Zellen zu infizieren. Um dieses virale Oberflächenprotein genauer zu untersuchen, wurden zwei rekombinante Sendai-Viren konstruiert (rSeV). Das eine Virus (rSeV-RSV-Fnat) erlaubt die Expression des nativen RSV-Fusionsproteins, das andere Virus (rSeV-RSV-Fch) die Expression eines chimären Fusionsproteins, in dem der zytoplasmatische Abschnitt und der Membrananker durch die entsprechenden Abschnitte des SeV-Fusionsproteins ersetzt wurden. Zum Vergleich wurde ein rekombinantes Sendai-Virus eingesetzt, welches ein Gen für einen autofluoreszierenden roten Farbstoff (DsRed) anstelle des Gens für das chimäre Fusionsprotein enthielt (rSeV-DsRed). Dieses Kontrollvirus benötigte für die Bildung infektiöser Virionen die Zusetzung von exogenem Trypsin, weil das SeV-Fusionsprotein anstatt eines multibasischen Spaltmotives nur ein singuläres Arginin an der Spaltstelle besitzt. Wie erwartet, war rSeV-DsRed in Zellkultur nur unter Zusetzung von Trypsin vermehrungsfähig. rSeV-RSV-Fch benötigte keine Gabe einer exogenen Protease für das Wachstum in Zellkultur und war folglich unabhängig vom SeV-Fusionsprotein. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Ektodomäne des RSV-Fusionsproteins eine Infektion für das Sendai-Virus vermitteln kann. Ebenso wie das chimäre Fusionsprotein wurde das native RSV-Fusionsprotein in die SeV-Partikel eingebaut, allerdings war es nicht in der Lage, eine Infektion zu vermitteln. Die Anteile des SeV-Fusionsproteins im chimären Konstrukt schienen für die Einleitung der Fusion wichtig zu sein, möglicherweise über eine Interaktion mit den anderen SeV-Proteinen. Eine Behandlung von Zellkulturen mit Neuraminidase führte dazu, dass die Zellen resistent wurden gegen eine Infektion mit rSeV-RSV-Fch. Offenbar ist rSeV-RSV-Fch abhängig von dem Bindungsvermögen des SeV-HN-Proteins an Sialinsäure-haltige Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Das RSV-Fusionsprotein kann also eine Fusion, nicht aber eine Bindung im Zusammenhang einer Sendai-Virus-Infektion vermitteln. Diese These wird dadurch gestärkt, dass sowohl Antikörper gegen RSV-F als auch gegen SeV eine Infektion mit rSeV-RSV-Fch vollständig neutralisierten. rSeV-RSV-Fch ist ein interessantes Werkzeug, um die Immunantwort zu untersuchen, die durch das RSV-F-Protein hervorgerufen wird. Die gezeigten Ergebnisse helfen, den Charakter des RSV-Fusionsproteins zu verstehen und können zur Verbesserung viraler Vektorsysteme für die Gentherapie und die Impfstoffentwicklung beitragen.

Preview

Quote

Citation style:

Hinz, Matthias: Charakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen Synzytialvirus mit Hilfe rekombinanter Sendai-Viren. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export