Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei osmotisch induzierter Volumenregulation von Spermatozoen am Ebermodell

Jebe, Eyke Christina

The signaling mechanisms and the possible involvement of the tyrosine phosphorylation in volume regulation were investigated. This study was a contribution to sperm cell physiology. Beltsville Thawing Solution (BTS) diluted ejaculates of four different boars were examined in this study. The volume changes were measured with a computer-controlled cell analyzer (based on electrical resistance measurement) under different osmotic conditions. Moreover, the influence of different inhibitors of protein phosphatases, protein kinases, Cl- channels and the cAMP-dependency was tested. The effect of these inhibitors on the tyrosine phosphorylation was investigated in iso-, hypo- and hypertonic saline solutions. Tyrosine phosporylation pattern were analyzed by 1-dimensional polyacrylamid-gelelectrophorese and immunoblotting. The phosphorylation rates were determinated by flow cytometer. The following results were obtained: Protein kinase C, and to a smaller extent protein kinase A and tyrosine kinase are involved in volume regulation under isoosmotic conditions. Further dephosphorylation by protein phosphatases PP2A and PP1 seems to participate in volume regulation. Additionally to protein phosphatase activated mechanisms, cAMP-dependent signaling appears to be involved in volume regulation.The involvement of Tamoxifen- und Forskolin-sensitive Cl- channels has been demonstrated. Under hypoosmotic stress PP2A and PP1 dependent channels are involved. Dephosphorylation mediated by PP2A and PP1 seems to be essential for regulative volume decrease (RVD). cAMP-dependent signaling seems to count for regulation occuring after blocking PP-dependent mechanisms and possibly Cl- channels. Tamoxifen and Forskolin-sensitive Cl- channels are involved in volume regulation under hypoosmotic conditions, too. Protein kinases may deactivate volume regulation mechanisms by closing channels or by inhibiting protein phosphatases involved in RVD. The missing effect of the inhibitors on mechanisms of volume regulation under hyperosmotic conditions points to the pivotal role of other transport mechanisms and ions, especially Na+ ions. Thus, sodium transport can be essential for regulation under hypertonic stress. Specific tyrosine phosphorylation sensitive to volume regulation was observed in proteins of 14,5 kDa, 27,0 kDa und 33,0 kDa. Under isoosmotic and hypoosmotic conditions an incubation of 20 minutes leads to an increasing tyrosine phosphorylation while under hyperosmotic conditions dephosphorylation takes place. The inhibitors effecting volume regulation inhibit tyrosine phosphorylation in either isoosmotic and hypoosmotic medium. In contrast, these effects do not occur under hyperosmotic conditions. A hypothesis about signal transduction mechanisms of volume regulation in boar sperms was developed on the basis of these results: Different Tamoxifen- and Dedoxy-Forskolin/ Forsklin-sensitive Cl- and K+ channels are involved in volume regulation. Protein phosphatases PP1 and PP2A may activate these transport channels. Activation of volume-regulatory mechanisms seems to be dependent on cAMP (by control of PP2A/PP1-dependent or other mechanisms). Tyrosine kinase and protein kinase A could inactivate protein phosphatases and lead to a restriction of volume regulation. Protein kinase C probably closes the channels activated by dephosphorylation. Here the first time a hypothesis about volume-regulatory mechanisms in mammalian sperms has been presented rendering the basis for extendered investigations.

Mit der vorliegenden Arbeit wurde das Ziel verfolgt, die an der Volumenregulation der Spermatozoen involvierten Signalübertragungsmechanismen und eine Beteiligung von Tyrosinphosphorylierungen näher zu untersuchen und damit einen Beitrag zum Verständnis der Zellphysiologie zu leisten. Im Rahmen der Studien wurden an den in Beltsville Thawing Solution (BTS) verdünnten Ejakulaten vier verschiedener institutseigener Eber die Volumenveränderungen mit Hilfe eines auf dem Widerstandsprinzip beruhenden elektrischen Partikelzählers gemessen. Dabei wurde der Einfluss von Proteinphosphatase- und Proteinkinase-Inhibitoren und verschiedenen Stoffen, die den intrazellulären cAMP-Spiegel beeinflussen, sowie Inhibitoren der Chloridkanäle unter verschiedenen osmotischen Belastungen getestet. Die Effekte dieser Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung wurden unter iso-, hypo- und hyperosmotischen Bedingungen untersucht. Nach der Auftrennung der Proteine mittels eindimensionaler SDS-Polyarylamid-Gelelektrophorese wurden die Muster der tyrosinphosphorylierten Proteine im Immunoblot analysiert. Eine Quantifizierung der Tyrosinphosphorylierungsintensität erfolgte im Durchflusszytometer. Folgende Ergebnisse ergaben sich: Proteinkinase C, in geringerem Umfang Proteinkinase A und Tyrosinkinase sind in die Volumenregulation in isoosmotischer Umgebung involviert. Einige cAMP-abhängigen Mechanismen wie die Aktivität der Proteinphosphatasen PP2A und PP1 scheinen ebenfalls beteiligt zu sein. Die Einbeziehung von Tamoxifen- und Forskolin-sensitiven Chloridkanälen ist nachgewiesen worden. Unter hypoosmotischen Belastungen scheint die durch PP2A und PP1 vermittelte Dephosphorylierung essentiell für das RVD (regulative Volumenabnahme) zu sein. Eine cAMP-Abhängigkeit von Chloridkanälen oder PP2A- und PP1- abhängigen Mechanismen kommt vor. Wie unter isoosmotischen sind auch unter hypoosmotischen Bedingungen Tamoxifen- und Forskolin-sensitive Chloridkanäle in die Volumenregulation involviert. Proteinkinasen deaktivieren vermutlich die Volumenregulation, indem sie Kanäle inaktivieren oder am RVD beteiligte Proteinphosphatasen hemmen. Der ausbleibende Effekt der Inhibitoren auf das hyperosmotische Volumen lässt darauf schließen, dass der Transport anderer Ionen unter diesen Bedingungen eine Rolle spielt. Der im Vergleich zu dem iso- und hypoosmotischen Medium erhöhte Natriumgehalt deutet auf die Bedeutung dieser Ionen hin. Bei der Volumenregulation finden Tyrosinphosphorylierungen von Proteinen im niedermolekularen Bereich statt. Proteine des Molekulargewichtes 14,5 kDa, 27,0 kDa und 33,0 kDa werden phosphoryliert. Unter isoosmotischen und hypoosmotischen Bedingungen wird bei verlängerter Inkubation von 20 Minuten eine zunehmende Tyrosinphosphorylierung der genannten Proteine beobachtet, unter hyperosmotischen Belastungen führt dies zu einer vermehrten Dephosphorylierung. Sowohl im isoosmotischen als auch im hypoosmotischen Versuchsmedium gelingt die Hemmung der Tyrosinphosphorylierung mit einigen der Inhibitoren, die die Volumenregulation beeinflussen. Im Gegensatz dazu treten diese Effekte nicht unter hyperosmotischen Bedingungen auf. Aus diesen aufgeführten Ergebnissen konnte eine Arbeitshypothese der an der Volumenregulation beteiligten Signaltransduktionsmechanismen bei porcinen Spermatozoen erstellt werden: An der Volumenregulation sind verschiedene Arten von Tamoxifen- und Dedoxy-Forskolin/ Forskolin–sensitiven Chlorid- und Kaliumkanälen beteiligt. Proteinphosphatasen PP1 und PP2A aktivieren die Transportkanäle. Die PP2A-bedingte Dephosphorylierung scheint cAMP-abhängig zu sein. Tyrosinkinase und Proteinkinase A inaktivieren wahrscheinlich die Proteinphosphatasen und ziehen eine Einschränkung der Volumenregulation nach sich. Den "Gegenspieler" zu den Phosphatasen stellt eventuell Proteinkinase C dar. Man geht davon aus, dass PKC vermutlich die durch die Dephosphorylierung aktivierten Kanäle schließt. Erstmalig gelang es, ein Modell für die an der Osmoregulation bei Eberspemien beteiligten Mechanismen aufzustellen, das eine Grundlage für die Klärung weiterer Details in weiterführenden, zielgerichteten Untersuchungen bietet.

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Jebe, Eyke Christina: Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei osmotisch induzierter Volumenregulation von Spermatozoen am Ebermodell. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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