Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen mittels RT-PCR

Küfen, Alexandra

The bovine spongiform encephalopathy (BSE), the possible routes of infection of BSE, and the new variant of the Creuzfeld-Jakob-disease (vCJD) which is closely connected with the first, have gained special attention with regard to preventive protection of consumers. The possible entry of specific risk material, particularly the entry of CNS tissue in the human food chain, is considered as a main root of infection. The illegal use of mechanically recovered meat in retail meat products and CNS-tissue as an emulgator in cooked sausages can not be excluded. Therefore appropriate control procedures for food and feeding are necessary in order to prevent CNS-tissue infiltrating the food- and feeding-chain. The method used in thesis in order to detect CNS-tissue in retail meat products is based on the detection of a168 bp sized fragment of mRNA of the glial acidic fibrillary protein (GFAP) by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Subsequent to the RT-PCR the classification of the species cattle by using a restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) had been carried out. Investigations made with regard to the tissue specificity of the GFAP-mRNA in porcine and ovine tissues revealed that the specification of CNS-tissue of these species is not possible so far, using the168 bp sized amplification product of the GFAP-mRNA as marker. Therefore only the bovine GFAP-mRNA is considered to be a save marker for the presence of CNS-tissue. Consequently the bovine origin of the detected GFAP-mRNA has to be proved. By the development of the RT-PCR using the primer pair bGFAPw1 and bGFAPw2 the necessary sequence information from sheep, pork, horse, fallow deer, roe deer and red deer to differentiate the respective amplification products were obtained. Using the restriction enzymes Hae III and Msc I the bovine GFAP-mRNA can be clearly identified. With beef sausage-products and liver sausages, which were spiked with bovine CNS-tissue in concentrations of 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % and 5 %, and which had a heating process up to 100°C temperature to undergo, the proof of GFAP-mRNA up to a concentration of 0,25 % was possible over a period of 35 days. Over a period of 28 days, the sensitivity of this method is up to 97 % in retail meat products, which were produced by a heating temperature up to 100°C. The specificity of the GFAP-mRNA RT-PCR assay for bovine CNS-tissue is 100 % in the experiments conducted here. Examination of canned food endowed with bovine CNS which were heated to FS-values over 5 revealed that the proof of GFAP-mRNA with the described method was not safely possible. Within the present thesis it can be stated that the used method is suitable to detect bovine CNS-tissue in meat products which were heated up to a temperature of 100°C.

Im Rahmen des vorbeugenden Verbraucherschutzes haben die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), die möglichen Übertragungswege der BSE und die mit dieser assoziierten neuen Variante der Creutzfeldt-Jakob Erkrankung (vCJD) erheblich an Bedeutung gewonnen. In diesem Zusammenhang ist der mögliche Eintrag von spezifiziertem Risikomaterial, insbesondere von Gewebe des zentralen Nervensystems, in die humane Lebensmittelkette von besonderem Interesse, da ein möglicher Einsatz von Separatorenfleisch und Gehirngewebe als Emulgator in Brüh- und Kochwürsten nicht ausgeschlossen werden kann. Das in dieser Arbeit verwendete molekularbiologische Verfahren zur Detektion von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen basiert auf dem für die Tierart Rind gewebespezifischen Nachweis eines 168 bp großen Fragments der mRNA des sauren Gliafaserproteins (GFAP) mittels reverser Transcriptase- Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR). Im Anschluss an die RT-PCR wird die Bestimmung der Tierart Rind mittels eines Restriktionsfragment Längenpolymorphismus (RFLP) durchgeführt. Die Untersuchungen zur Gewebespezifität der GFAP-mRNA beim Schwein und Schaf zeigen, dass die hier verwendete Methode anscheinend nicht geeignet ist, um ZNS-Gewebe von Schaf und Schwein in Fleischerzeugnissen mit ausreichender Gewebespezifität nachzuweisen. Daher ist bisher nur die bovine GFAP-mRNA ein sicherer Marker für ZNS-Gewebe. Deshalb muss die bovine Herkunft dieses Signals verifiziert werden. Durch die Entwicklung der RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 und die anschließende Sequenzierung der erhaltenen Amplifikate konnten die notwendigen Sequenzinformation zum entsprechenden GFAP-mRNA Abschnitt der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild und Rotwild erarbeitet werden. Durch die Restriktionsenzyme Hae III und Msc I ist die GFAP-mRNA der Tierart Rind sicher identifizierbar.                         In den Brühwursterzeugnissen aus Rinderfleisch und Leberwürsten, die mit bovinen ZNS-Gewebe in den Konzentrationsstufen 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 % dotiert wurden, und verschiedenen Erhitzungsbedingungen bis 100°C unterzogen wurden, ist der Nachweis des 168 bp großen Amplifikats der bovinen GFAP-mRNA ab einer Konzentration von 0,25 % ZNS-Gewebe über einen Zeitraum bis zu 35 Tagen möglich. Bei einem Untersuchungszeitraum von 28 Tagen lag die Sensitivität dieser Methode bei 97 % für Fleischerzeugnisse, die mit Temperaturen bis zu 100°C erhitzt wurden, die Gewebespezifität für bovines ZNS-Gewebe lag bei 100 %. Bei der Untersuchung der mit bovinen ZNS-Gewebe dotierten Vollkonserven mit einem FS-Wert von über 5 ist der Nachweis der GFAP-mRNA mit der hier verwendeten Methode nicht sicher möglich. In der hier vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die verwendete molekularbiologische Methode geeignet ist, bovines ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen, die mit Temperaturen bis zu 100°C erhitzt wurden, nachzuweisen.

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Küfen, Alexandra: Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen mittels RT-PCR. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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