Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines ACTH-Bioassays

Küster, Sonja

The cushing`s syndrome of the dog is in over 80% of cases pituitary-dependent with excessive secretion of adrenocorticotropic hormone (ACTH). To differentiate between pituitary- and adrenal-dependent hyperadrenocorticism it is often advised to determine basal endogenous ACTH concentrations. In our laboratory ACTH concentrations are measured using the automated IMMULITEâ -system (DPC Biermann, Bad Nauheim), a chemiluminescence immunoassay. However, in the majority of samples in which a hyperadrenocorticism was diagnosed contrary to expectations only minimal ACTH concentrations are measured. Since the IMMULITEâ -system only registers the intact ACTH1-39 (irACTH), the question arises how this relates to the ACTH bioactivity (bioACTH). Therefore the aim of the present study was: · Development of an ACTH-bioassay with porcine adrenocortical cells · Establishment of an ACTH calibration curve for determination of bioACTH in canine blood samples · Comparison between ACTH bioactivity and immunoreactivity in canine blood samples The ACTH-bioassay was carried out with adrenal glands of young slaughter pigs. A cell suspension was prepared in a culture medium by collagenase treatment. During the whole procedure the cells were treated with extreme care since the magnitude and sensitivity of the cell response to hormone stimulation is strongly correlated with cell quality. By adding different concentrations of synthetic ACTH1-24 (Tetracosactid, Synactenâ ) an ACTH calibration curve was established by which means the bioACTH of each sample that was applied into the bioassay was determined as equivalent of Synactenâ in pg/ml. It could be demonstrated that the bioassay yields quantitativly reproducable results. Attempts to remove endogenous cortisol from native blood samples failed. The steroid absorption on activated carbon as well as the steroid extraction with solvent led to inhibition of the cell`s cortisol production. Examination of a possible serum effect brought the result that there must be substances in the undiluted serum that inhibit cortisol production. The mechanism of this inhibition is not clear, nor is the identity of the substances. At fourfold dilution of the samples no inhibition was observed. For determination of bioACTH in canine blood samples three groups of five dogs were examined: healthy dogs, those affected with cushing`s syndrome and dogs treated with Mitotane (Lysodrenâ ). Subsequently the bioACTH values were compared with the irACTH values measured in the IMMULITEâ . Because of the small amount of specimen in this study only tendencies were demonstrated. In 87% of examined samples ACTH bioacticity was larger than immunoreactivity. One of the cushing samples and three of the Lysodrenâ samples led to maximum bioACTH values of >1.250 pg/ml despite clearly lower irACTH values. These results allow the conclusion that the IMMULITEâ -system does not reflect the bioactivity of endogenous ACTH in canine cushing`s syndrome. The measured irACTH concentrations are merely expressive in positiv cases. Although the ACTH-bioassay requires more time and is more susceptible to disturbing factors, it better reflects the in vivo conditions. The use of the ACTH-bioassay in the diagnosis of canine cushing`s syndrome seems to be useful especially in those cases, in which other methods of measuring as well as endocrinological functional tests do not come up with clear results. Other basic illnesses such as diabetes mellitus can affect the hypothalamus-pituitary-adrenal axis and therefore complicate the diagnosis. Here the ACTH-bioassay offers a further possibility to clarify the existence of a hyperadrenocorticism.

Das Cushing-Syndrom des Hundes ist in über 80% der Fälle hypophysär bedingt mit einer übermäßigen Sekretion des adrenocorticotropen Hormons (ACTH). Zur Unterscheidung zwischen hypophysärem und andrenalem Hyperadrenocorticismus wird häufig die Bestimmung der basalen endogenen ACTH-Konzentration empfohlen. Im hiesigen Labor werden die ACTH-Konzentrationen mit dem automatisierten IMMULITEâ -System (DPC Biermann, Bad Nauheim) gemessen, einem Chemilumineszenz-Immunoassay. In der Mehrzahl der Proben, bei denen ein Hyperadrenocorticismus diagnostiziert wurde, sind jedoch wider Erwarten nur minimale ACTH-Konzentrationen zu messen. Da das IMMULITEâ -System lediglich das intakte ACTH1-39 (irACTH) erfaßt, stellt sich die Frage, wie es sich mit der ACTH-Bioaktivität (bioACTH) verhält. Die vorliegende Studie wurde daher mit folgender Aufgabenstellung durchgeführt: · Entwicklung eines ACTH-Bioassays mit porcinen Nebennierenrindenzellen · Erstellen einer ACTH-Eichkurve zur Bestimmung des bioACTH in caninen Blutproben · Vergleich zwischen der ACTH-Immunraktivität und der ACTH-Bioaktivität in caninen Blutproben Der ACTH-Bioassay wurde mit Nebennieren von jungen Schlachtschweinen durchgeführt. Die Vereinzelung der Zellen erfolgte in einem Kulturmedium unter Zugabe von Kollagenase. Während der gesamten Prozedur wurden die Zellen mit großer Sorgfalt behandelt, da die Größe und Sensitivität der Zellantwort auf die hormonelle Stimulation mit der Zellqualität in einem engen Zusammenhang steht. Durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen an synthetischem ACTH1-24 (Tetracosactid, Synactenâ ) konnte eine ACTH-Eichkurve erstellt werden, anhand derer das bioACTH jeder im Bioassay eingesetzten Probe als Äquivalent des Synactenâ in pg/ml ermittelt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass der Bioassay quantitativ reproduzierbare Aussagen liefert. Die Versuche endogenes Cortisol aus nativen Blutproben vor deren Einsatz im Bioassay zu entfernen schlugen fehl. Sowohl die Steroidabsorption an Aktivkohle als auch die Steroidextraktion mit Lösungsmitteln führten zu einer Hemmung der basalen Cortisolproduktion der Zellen. Die Untersuchung eines möglichen Serumeffektes brachte das Ergebnis, dass im unverdünnten Serum Substanzen vorhanden sind, die sich hemmend auf die Cortisolproduktion auswirken. Der Mechanismus dieser Hemmung ist unklar, ebenso die Identität der Substanzen. Bei 4facher Verdünnung der Serumproben war keine Hemmung mehr zu beobachten. Zur Bestimmung des bioACTH in caninen Blutproben wurden drei Versuchsgruppen mit jeweils fünf Hunden untersucht: gesunde, am Cushing-Syndrom erkrankte und mit Mitotane (Lysodrenâ ) therapierte Hunde. Anschließend wurden die bioACTH-Werte mit den im IMMULITEâ gemessenen irACTH-Werten verglichen. Aufgrund des geringen Stichprobenumfanges wurden an dieser Stelle lediglich Tendenzen aufgezeigt. In 87% der untersuchten Proben war die ACTH-Bioaktivität größer als die Immunreaktivität. Eine der Cushing-Proben und drei der Lysodrenâ -Proben führten trotz deutlich geringerer irACTH-Werte zu maximalen bioACTH-Werten von >1.250 pg/ml. Diese Ergebnisse lassen die Schlußfolgerung zu, dass das IMMULITEâ -System beim caninen Cushing-Syndrom nicht die Bioaktivität des endogenen ACTHs widerspiegelt. Die gemessenen irACTH-Konzentrationen sind lediglich im positiven Fall aussagekräftig. Der ACTH-Bioassay ist zwar mit einem höheren Zeitaufwand verbunden und anfälliger gegen Störfaktoren, er spiegelt jedoch die in vivo Verhältnisse besser wieder. Der Einsatz des ACTH-Bioassays in der Diagnostik des caninen Cushing-Syndroms erscheint besonders in den Fällen sinnvoll, in denen andere Messmethoden sowie endokrinologische Funktionstests keine eindeutigen Ergebnisse liefern. Andere Grunderkrankungen, wie z.B. ein Diabetes mellitus, können die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse beeinflußen und die Diagnstik komplizieren. Hier bietet der ACTH-Bioassay eine weitere Möglichkeit zur Abklärung des Vorliegens eines Hyperadrenocorticismus.

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Küster, Sonja: Entwicklung eines ACTH-Bioassays. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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