Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung einer reversen Genetik zur Charakterisierung des Oberflächen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus

Larisch, Birthe

Influenza C virus, a member of the family Orthomyxoviridae, is a negative-sense RNA virus with a genome that contains seven segments. There is only one major surface protein integrated into the viral membrane. This glycoprotein is designated HEF because it has three activities: haemagglutination (receptor-binding), esterase and membrane fusion. The receptor-binding activity depends on the interaction with N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid present on the surface glycoproteins or glycolipids of the target cell. To characterise the receptor-binding activity of HEF by analysis of mutants, different expression systems were evaluated. In one set of experiments the HEF protein should be incorporated into vesicular stomatitis virions (VSV). For this purpose a chimeric protein was generated which contained the HEF ectodomain and the membrane anchor and cytoplasmic tail of the VSV G protein. This protein was correctly transported to the cell surface and has retained functionality as indicated by esterase and hemadsorption (binding of erythrocytes to HEF expressing cells) activity. However, neither native nor chimeric HEF proteins was found to be incorporated into VSV particles. In a second set of experiments, virus like particles (VLP) were generated by coexpression of the genes coding for the HEF and the matrix protein. However the amount of VLPs released into the cell supernatant was too low to allow analysis of HEF mutants. The major part of this work was dedicated to the establishment of a reverse genetics system for influenza C virus, i.e. the generation of infectious virus from cDNA. For this purpose full length RNAs were obtained from the seven segments cloned into the vector pPolISapIRib which allows RNA polymerase I dependent transcription. In addition all influenza C genes were cloned into an expression plasmid to provide the viral proteins, especially the polymerase complex for successful replication. For easy detection of gene expression the gene coding for the green fluorescent protein (GFP) was cloned into the HEF gene segment. Using GFP as a reporter the replication complex was shown to correctly replicate and transcribe this RNA segment. However, no VLPs containing the GFP gene were released into the supernatant. However, when cells transfected with the plasmid GFPinHEFdel were infected by influenza C virus the newly formed virions incorporated the GFP gene. The same approach was applied to a mutant HEF gene (MutaHEF). To detect expression of this protein above the background of the HEF proteins of the helper virus a mutant HEF was used which recognizes 9-O-acetylated sialic acid with high efficiency. However, this property did not allow the reproducible selection of virus containing the mutant protein. Experiments to generate infectious influenza C virus only from cDNA were not successful. In the future the rescue conditions have to be optimized. Recombinant influenza C virus is a promising candidate for gene therapy in the respiratory tract.

Das Influenza-C-Virus, das zur Familie der Orthomyxoviridae gehört, ist ein RNA-Virus negativer Polarität mit einem Genom, das aus sieben Segmenten besteht. In der viralen Membran ist nur ein Haupt-Oberflächenprotein verankert. Dieses Glykoprotein wurde HEF genannt, weil es die drei biologischen Aktivitäten besitzt: Hämagglutination (Rezeptorbindung), Esterase und Fusion. Die rezeptorbindende Aktivität hängt von der Interaktion mit N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure ab, die auf Oberflächenproteinen oder -lipiden der Zielzellen vorhanden ist. Um die rezeptorbindende Aktivität des HEF-Proteins durch Analyse von Mutanten zu charakterisieren, wurden verschiedene Expressionssysteme untersucht. Im ersten Teil dieser Untersuchungen sollte das HEF-Protein in das Virus der Vesikulären Stomatitis eingebaut werden. Zu diesem Zweck wurden chimäre Proteine erzeugt, die die Ektodomäne des HEF-Proteins und den Membrananker sowie den cytoplasmatischen Anteil des VSV-G-Proteins enthielten. Diese Proteine wurden korrekt zur Zelloberfläche transportiert und waren funktionell, was sich durch Esterase- und Hämagglutinationsaktivität (das Binden von Erythrozyten an HEF-exprimierende Zellen) zeigte. Aber weder das native noch die chimären HEF-Proteine wurden in VSV-Partikel eingebaut. Im nächsten Schritt wurden virusähnliche Partikel (VLP) durch Co-Expression der Gene, die für das HEF- und M-Protein kodieren, erzeugt. Die Menge an VLPs, die in den Zellkulturüberstand freigesetzt wurde, reichte nicht aus, um auf diese Weise HEF-Mutanten zu untersuchen. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung einer reversen Genetik für das Influenza-C-Virus, d.h. mit der Erzeugung von infektiösen Viren ausschließlich aus cDNA. Zu diesem Zweck wurden die RNA-Segmente in voller Länge in den Vektor pPolISapIRib kloniert, der die Transkription durch die RNA-Polymerase-I ermöglicht. Zusätzlich wurden alle Influenza-C-Gene in einen Expressionsvektor kloniert, der die viralen Proteine und vor allem den Polymerasekomplex, der für eine erfolgreiche Replikation verantwortlich ist, erzeugt. Um die Genexpression einfach detektieren zu können, wurde das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) in das HEF-Gen kloniert. Durch die Benutzung des GFP-Gens als Reporter konnte gezeigt werden, dass dieses RNA-Segment durch den Replikationskomplex korrekt repliziert und transkribiert wurde. Im Zellkulturüberstand konnten allerdings keine VLPs, die das GFP-Gen enthielten, nachgewiesen werden. Als jedoch Zellen mit dem Konstrukt GFPinHEFdel transfiziert und mit Helfervirus überinfiziert wurden, konnten neugebildete Virionen, die das GFP-Gen enthielten, nachgewiesen werden. Derselbe Versuch wurde mit dem HEF-Gen durchgeführt. Um die Expression dieses Proteins über dem Hintergrund der HEF-Proteine des Helfervirus zu entdecken, wurde eine HEF-Mutante benutzt, die eine höhere Affinität zu 9-O-acetylierten Sialinsäuren aufweist. Aber diese Eigenschaft erlaubte keine reproduzierbare Selektion von Viren, die das veränderte Protein enthalten. Die Versuche, ein rekombinantes Influenza-C-Virus allein aus cDNA zu erzeugen, waren nicht erfolgreich. Für die Zukunft sollten die Bedingungen zur Erzeugung eines rekombinanten Virus allein aus cDNA noch verbessert werden. Ein rekombinantes Influenza-C-Virus ist ein vielversprechender Kandidat für die Gentherapie am Respirationstrakt.

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Larisch, Birthe: Etablierung einer reversen Genetik zur Charakterisierung des Oberflächen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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