Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch: Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray

Leidreiter, Melanie Tina

Species-specific detection of Listeria monocytogenes contaminating ground pork was demonstrated by performing various methods. For this purpose, samples were artificially inoculated with about 20 - 30 cfu g-1. Special care was taken with the homogenous distribution of the inoculated bacteria by colouring of the ground pork with an additive (E 151). For control, the inoculated ground pork had to get evenly blue-coloured. As a conventional method, DIN EN ISO 11290-1 (1996), and ests entional method)d, oured. as rapid methods multiplex PCR (detection of target DNA with agarose gel electrophoresis and also with microarray analysis, respectively) as well as a sandwich-ELISA were performed. Generally, to reach level of detection, the amount of target cells needed to be increased. This was done by selective enrichment carried out in half-Fraser broth at 30°C (conventional method) or 37°C (rapid methods). Conditions served well to support (detection of  growth of target cells in a most satisfactory way. As long as Listeria innocua was absent, cultural DIN EN ISO method (1996) gave no false-negative results. The rate of detection was 100 %, and results were obtained within 5 days. However, in presence of Listeria innocua, which is the most frequent indicator for a contamination with Listeria monocytogenes in meat and meat products (often occurs in mixed contamination with this pathogen), sensitivity was reduced considerably. Almost 50 % of the samples, contaminated artificially with both species in mixed culture, escaped detection. Therefore, new types of solid media, which have been designed to differentiate between Listeria monocytogenes and other Listeriae, e. g. ALOA, a chromogenic medium, should be integrated with the current official cultural method (according to § 35 LMBG). Transia plate™ Listeria monocytogenes ELISA system served as well as the other rapid methods did. It is to be found superior to the current official cultural method, since positive or negative findings are possibly available within 28 hours after starting enrichment. The minimum enrichment period – determined with 24 hours – represents the high sensitivity of the ELISA method, though the ELISA is not as sensitive as methods based on molecular biology techniques. By amplification of two virulence gene fragments, multiplex PCR followed by agarose gel electrophoresis gives evidence of Listeria monocytogenes with equal reliability. The detection of DNA was less sensitive when performed with microarrays: with agarose gel electrophoresis, it took 16 hours of enrichment to detect the pathogen in every sample.h the other methods used here.   Running DNA microarray analysis, this innovative method of detection proved to be the most rapid, since the most reduced enrichment period led to a positive finding. For this purpose, enrichment period could be reduced to a minimum of 10 hours. Positive detection was possible with the smallest amounts of target cells in comparison with the other methods used here. In contrast to the official cultural method, microarray analysis, at any rate, made detection of Listeria monocytogenes feasible even in mixed contamination with Listeria innocua. With naturally contaminated foods, both PCR detection systems led to satisfactory results. Microarray analysis is predetermined for automation. Furthermore, the employed NUTRI™-Chip is also prepared with probes against specific DNA-sequences of Salmonella and Campylobacter. A simultaneous detection of three food-borne pathogens in one food sample then becomes possible. However when tested, each detection system proved especially compatible with any of the single factors given:  target organism, enrichment medium, length of incubation or minimum enrichment period (characteristics of applied detection methods). Furthermore, they constitute integral systems that should be useful for routine application. These rapid methods are most reliable and tim e – saving with diagnosis obtained on the second day of analysis. Microarray analysis is the most sensitive rapid method.

Die vorliegende Untersuchung diente dem vergleichenden Nachweis von Listeria monocytogenes in dotiertem Hackfleisch mittels kultureller Referenzmethode nach § 35 LMBG, ELISA (Transia plate Listeria monocytogenes), Multiplex-PCR und Microarray in Hinblick auf Sensitivität und Spezifität. Daneben erfolgte eine vergleichende Untersuchung von 71 Feldproben von Lebensmitteln, von denen in 49 Proben zuvor kulturell der Nachweis von Listeria monocytogenes erfolgt war. Schweinehackfleisch wurde unter kontrollierten Bedingungen mit 20 – 30 KbE L. monocytogenes pro Gramm inokuliert. Die homogene Verteilung wurde über Färbeversuche des Probengutes mit einem zu der Keimsuspension zugemischten Lebensmittelfarbstoff (Brillantschwarz, E 151) kontrolliert. Außerdem wurden in einem weiteren Ansatz Hackfleischproben mit Mischkulturen von Listeria monocytogenes und Listeria innocua im Verhältnis 1:1,2 inokuliert.  Die dotierten Proben wurden anschließend in selektiven Anreicherungsmedien inkubiert. Für die kulturelle Referenzmethode wurde eine primäre Anreicherung bei 30°C und für ELISA, PCR und Microarray eine Anreicherung bei 37°C in Halbfraser-Bouillon durchgeführt. Für die kulturelle Nachweisführung erfolgte zudem eine Sekundäranreicherung. Zur Bestimmung der für die Schnellmethoden erforderlichen Mindestanreicherungszeiten, anhand derer die Sensitivität der einzelnen Methoden zu bemessen war, wurde die Dauer der Inkubation variiert und sukzessive reduziert. Der Zeitraum der Inkubation, nach dem erstmals jede Probe als Listeria monocytogenes-positiv bewertet werden konnte, wurde als Mindestanreicherungszeit definiert. Mit der kulturellen Nachweismethode konnte Listeria monocytogenes mit einem Gesamtuntersuchungsaufwand von 5 Tagen in 100 % der Proben nachgewiesen werden. Bei Mischinokulationen mit Listeria innocua war der Zielkeim Listeria monocytogenes in 46,7 % der Proben nicht nachweisbar. Mit dem ELISA wurde Listeria monocytogenes nach einer Mindestanreicherungszeit von 24 Stunden in allen Proben nachgewiesen. Die Multiplex-PCR führte bereits nach einer Anreicherungszeit von 16 Stunden in 100 % der Proben zum sicheren Nachweis von Listeria monocytogenes. Als sensitivste Nachweismethode wurde die Microarray-Analyse identifiziert, bei der eine Mindestanreicherungszeit von lediglich 10 Stunden erforderlich war, um eine ursprüngliche Kontamination von 13 KbE Listeria monocytogenes pro Gramm sicher nachzuweisen. Beeinträchtigungen durch Mischkontaminationen mit Listeria innocua traten ebenfalls nicht auf. Der Vergleich der Nachweismethoden anhand von Untersuchungen von Feldproben auf eine natürliche Kontamination mit Listeria monocytogenes ergab insgesamt eine 86,6 %ige Übereinstimmung der Schnellmethoden mit den kulturell erhobenen Ergebnissen. In 6 bzw. 5 von 22 Proben konnte mit PCR bzw. Microarray eindeutig Listeria monocytogenes nachgewiesen werden, obwohl diese mittels kultureller Referenzmethode als negativ diagnostiziert wurden.

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Leidreiter, Melanie Tina: Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch: Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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