Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer Berücksichtigung der Chemilumineszenz

Merle, Roswitha

The diagnosis of mastitis has been extended beyond cytobacteriology to the analysis of differential cell counts along with the cell functionality of milk. The chemiluminescence (CL) is a procedure for determining PMN functionality in blood, sometimes also used for milk PMN. In the present work the udder health categorised by means of bacteriology, somatic cell counts (SCC), electrical conductivity and NAGase, was evaluated by functional methods, i. e. phagocytosis and chemiluminescence of blood and milk PMN as well as the microscopic cell differentiation of milk. Regarding methodic investigations for the determination of the CL activity in a luminometer, the procedure was optimized as follows: Ø      Isolation and storage of the cells on ice, by a maximum of six hours Ø      Cell concentration: 4 x 106 cells / ml Ø      PMA concentration: 750 ng PMA / ml Ø      pH-value: 10.0 The comparison of healthy animals with animals who were sick on all udder quarters as well as those that had fallen ill on one to three quarters (experiment 1), showed that the determination of the functionality of blood PMN is not sufficient to judge the udder health state, though it describes the general health of the animals. Analysis of quarter milk for the determination of the health status is therefore indispensable. In a weekly trial over the first three months of lactation (experiment 2), three udder healthy as well as three diseased animals were included. During lactation healthy animals showed a constant cell count in milk with a differential cell count dominated by lymphocytes in milk and slightly increasing tendencies in phagocytosis (from approx. 45 % to about 60 % cells in the non opsonisized tests) and CL activity (from approx. 1,000 to approx. 4,000 units / 1 million PMN) in the milk cell suspensions. While within the diseased animals higher cell counts were closely linked to mastitic quarters only (approx. 200,000 cell / ml), increased PMN fractions in differential cell counts and functional activity were also observed in neighouring quarters, although not as marked as in the diseased ones. After convalescence the PMN fraction and the functional activity remained high compared to the healthy animals and the differences between the healthy and the sick quarters of diseased cattles also persisted. Within classification of udder health on animal level of 36 animals (experiment 3), a rise in the PMN fraction from 29 % to 72 % and in the CL activity from approx. 5,000 to about 8,800 units / 1 million PMN in the milk cell suspensions was found in association with increasing cell numbers, although in most cases only one udder quarter per animal was affected. Data from blood (number of leucocytes, cell differential count, CL activity) ranged, if available, within their reference values and did not differ between the groups, so all animals could be considered generally healthy. The evaluation of data from affected and unaffected quarters of udder-diseased animals revealed a mutual influence within udder quarters from one animal. By systemic influences the healthy quarters of sick cows compared to the quarters of healthy animals presented a high PMN fraction in milk (38 %), but a lower CL capacity (approx. 2,600 units / 1 million PMN). The underlying immunological processes could not be clarified completely. Considering inflammable changes above 100,000 cells / ml milk both the PMN fraction and the cell activity in the milk cell suspensions rised from moderately (SCC 100,000 – 400,000 cells / ml) to seriously (SCC > 400,000 cells / ml) diseased udder quarters. Cell differential counts and functional cell activities of healthy and diseased quarters in the same cows varied probably because of different local defensive components in milk (mediators). The categorisation of the data by cytobacteriologically means showed that the cell differentiation as well as the cell functionality were influenced more by the cell count than by the bacteriological status. The evaluation of udder health on quarter level (n = 171 quarters) made clear that the cell activity in milk was enhanced with increasing cell counts in milk. The cell counts between 50,000 and 200,000 cells / ml milk were considered to be a beginning of inflammatory changes in the udder since changes in cell differentiation and cell functionality were observed continuously from this cell count level on. 3,000 to 6,000 CL units / 1 million PMN in milk represented the beginning of defence reactions in the udder quarter, while CL activities in milk > 6,000 units / 1 million PMN are likely to be indicative of an udder illness. These values corresponded to the above-mentioned cell counts and to a rise of the PMN fraction in the milk cell suspension. The evaluation of blood and milk cell functionality in parameters of udder health an milk cell differentiation showed positive effects on udder health catgorization even when commonly-empolyed diagnostic procedures yielded little evidence of inflammation. Moreover, a clear functional influence of sick quarters to the unaffected neighbouring quarters was proven.  

Die Diagnostik von Mastitiden schließt neben der zytobakteriologischen Untersuchung zunehmend die Analyse der Zelldifferentialbildes sowie der Zellfunktionalität aus Milch mit ein. Die Chemilumineszenzmessung (CL) ist ein Verfahren zur Bestimmung der Zellfunktionalität von PMN aus Blut, das seit einiger Zeit auch an PMN aus Milch durchgeführt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Eutergesundheit, welche anhand von Bakteriologie, Anzahl somatischer Zellen (SCC), elektrischer Leitfähigkeit und NAGase kategorisiert wurde, mit den funktionellen Nachweisverfahren Phagozytose und Chemilumineszenz von PMN aus Blut und aus Milch sowie dem mikroskopischen Zelldifferentialbild aus Milch in Zusammenhang gebracht. Im Rahmen methodischer Untersuchungen zur Bestimmung der CL-Aktivität im Luminometer wurde die Vorgehensweise wie folgt optimiert: Ø      Isolation und Lagerung der Zellen auf Eis, eine bis maximal sechs Stunden Ø      Zellkonzentration: 4 x 106 Zellen / ml Ø      PMA-Konzentration: 750 ng PMA / ml Ø      pH-Wert: 10,0 Der Vergleich gesunder Tiere mit Tieren, die auf allen Eutervierteln erkrankt waren, sowie mit solchen, die auf ein bis drei Vierteln erkrankt waren (Versuch 1), zeigte, dass die Funktionalitätsbestimmung von Blut-PMN zwar die Allgemeingesundheit der Tiere beschreibt, aber nicht ausreicht, um den Eutergesundheitszustand zu beurteilen. Die Untersuchung von Viertelgemelken zur Feststellung des Eutergesundheitsstatus ist unentbehrlich. In einer wöchentlichen Verlaufsuntersuchung über die ersten drei Laktationsmonate (Versuch 2) wurden drei eutergesunde sowie drei kranke Tiere einbezogen. Die gesunden Tiere wiesen im Laktationsverlauf neben einer konstanten Zellzahl und einem von Lymphozyten dominierten Zelldifferentialbild in Milch geringfügig steigende Tendenzen in der Phagozytose- (von ca. 45 % auf etwa 60 % aktive Zellen in den nicht opsonisierten Proben) und der CL-Aktivität (von etwa 1.000 bis ca. 4.000 Einheiten / 1 Mio. PMN) der Milchzellsuspensionen auf. Die Tiere, die an Mastitis erkrankten, hatten zwar nur in den betroffenen Eutervierteln erhöhte Zellzahlen (ca. 200.000 Zellen / ml Milch), der Anteil PMN im Zelldifferentialbild sowie die funktionelle Aktivität der Zellen in Milch stiegen jedoch auch in den benachbarten Vierteln, allerdings weniger ausgeprägt. Nach Abklingen der Mastitis blieben der PMN-Anteil und die funktionelle Aktivität im Vergleich zu den gesunden Tieren erhöht, bestehen blieben auch die abweichenden Zelldifferentialbilder und Zellaktivitäten zwischen den gesunden und den kranken Vierteln der erkrankten Tiere. Im Rahmen einer Beurteilung der Eutergesundheit auf Tierebene an 36 Tieren (Versuch 3) wurde mit zunehmendem Krankheitsgeschehen (Zellzahlanstieg) ein Anstieg des PMN-Anteils von 29 % auf 72 % und der CL-Aktivität von ca. 5.000 auf etwa 8.800 Einheiten / 1 Mio. PMN in den Milchzellsuspensionen festgestellt, obwohl meist nur ein Euterviertel pro Tier erkrankt war. Die aus Blut gewonnenen Daten (Leukozytenzahl, Zelldifferentialbild, CL-Aktivität) befanden sich, soweit vorhanden, innerhalb ihrer Referenzwerte und unterschieden sich nicht zwischen den gebildeten Gruppen, sodass alle Tiere als allgemeingesund betrachtet werden konnten. Die differenzierte Auswertung betroffener und nicht betroffener Viertel euterkranker Tiere ließ eine Abhängigkeit der Euterviertel eines Tieres voneinander erkennen. Durch systemische Einflüsse hatten die gesunden Viertel kranker Kühe im Vergleich zu den Vierteln gesunder Tiere einen hohen Anteil PMN in Milch (38 %), aber eine niedrigere CL-Aktivität (ca. 2.600 Einheiten / 1 Mio. PMN). Die dabei zugrunde liegenden immunologischen Vorgänge konnten nicht grundsätzlich geklärt werden. Auch im Bereich entzündlicher Veränderungen oberhalb von 100.000 Zellen / ml Milch stiegen der PMN-Anteil und die Zellaktivität in der Milchzellsuspension von mittelgradig (SCC 100.000 – 400.000 Zellen / ml) zu hochgradig (SCC > 400.000 Zellen / ml) erkrankten Eutervierteln an. Vermutlich aufgrund unterschiedlicher lokaler Abwehrkomponenten in der Milch (Mediatoren) variierten die Zelldifferentialbilder und die funktionellen Zelleigenschaften gesunder und kranker Viertel derselben Tiere stark. Die Einteilung der Daten anhand der zytobakteriologischen Ergebnisse zeigte, dass das Zelldifferentialbild sowie die Zellfunktionalität stärker von der Zellzahl als vom bakteriologischen Status beeinflusst werden. Die Beurteilung der Eutergesundheit auf Viertelebene (n = 171 Viertel) ließ erkennen, dass die Zellaktivität in Milch mit zunehmender Zellzahl stieg. Dabei schien es geeignet, den Zellzahlbereich zwischen 50.000 und 200.000 Zellen / ml Milch als Beginn entzündlicher Veränderungen zu betrachten, da auch die Zelldifferenzierung und die Zellfunktionalität in diesem Bereich kontinuierliche Veränderungen aufwiesen. 3.000 bis 6.000 CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in Milch stellten beginnende Abwehrreaktionen im Euterviertel dar, während CL-Aktivitäten in Milch über 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN auf die Manifestation einer Eutererkrankung schließen ließ. Diese Werte stimmten mit den oben genannten Zellzahlen und einem Anstieg des PMN-Anteils in der Milchzellsuspension überein. Die Einordnung funktioneller Eigenschaften von PMN aus Blut und Milch in die Parameter der Eutergesundheit sowie die Zelldifferenzierung aus Milch ließ steigende Zellaktivitäten im Zusammenhang mit einem Mastitisgeschehen bereits dann erkennen, wenn der Zellzahlbefund selbst wenig auf entzündliche Vorgänge hinwies. Zudem wurde ein deutlicher funktioneller Einfluss kranker Viertel auf die nicht betroffenen benachbarten Viertel nachgewiesen.

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Merle, Roswitha: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer Berücksichtigung der Chemilumineszenz. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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