Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose

Munder, Antje

In the present study the murine lung infection model with Listeria (L.) monocytogenes by view-controlled intratracheal (i.t.) instillation was established. First, four techniques for delivery of listeria to murine lungs were compared. View-controlled i.t. instillation was superior to the other three modes of intranasal delivery, blind i.t. instillation or inoculation via tracheotomy (MUNDER et al., 2002). Since the right and left lungs were targeted with similar amounts of listeria, the left lung was chosen for bacterial viable counts and the right lung for histological examination as endpoints of experiments. Comparing an intragastric (i.g.) and an i.t. induced listerial infection, it was shown that pulmonary contamination occurred after i.g. application and there was a quick dissemination from the lung after i.t. application. In conclusion the lung is not a closed compartment for containment of listeria. Inbred mice strains BALB/c, DBA/2 and C57BL/6 are known to be differentially susceptible to a parenteral infection with L. monocytogenes EGD. In the present study it was demonstrated that BALB/c- and DBA/2-mice are as susceptible to an i.t. infection as to a parenteral infection, whereas C57BL/6-mice turned out to be resistant towards both modes of infection. Infected with the attenuated bacterial strain L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP no differences were seen between the three inbred strains. The attenuated strain was less virulent in mice; an infection dose of 1000 x LD50 of the wildtype bacteria did not cause any lethal infections.No basic differences in the kinetics of the infection in lung, spleen, liver and brain were detected in comparison to the wildtype strain and no differences were observed depending on the dose of infection. Characterisation of the early course of infection subsequent to i.t. infection demonstrated a relatively low bacterial burden in spleen, liver and brain, implying that the first 18 hours after infection might be interesting for possible transfections. Furthermore, pathohistologically detected signs of inflammation were more often observed after this period and predominantly in the form of peribronchial and perivascular infiltrations of alveolar macrophages and neutrophils. To apply listeria as a vector for somatic gene therapy, it is an indispensable prerequisite that these bacteria invade lung epithelial cells. In this study confocal laser microscopy, electron scanning and transmission electron microscopy were employed to determine the exact localisation of listeria in the lung. In spite of varied doses of infection at different time points, bacteria of the strain L. monocytogenes EGD could be detected in epithelial cells only sporadically und not in a reproducible way.Although KRUSCH et al. (2002) observed the transfection of cells with the strain L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in vitro, in the present study the attenuated listeria did not have the ability to invade lung epithelial cells in vivo.In summary, the view controlled i.t. instillation represents a non-invasive method which produces stable and reproducible infections in the murine lungs. The reduced virulence of L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP strain allows infection of the lung of susceptible mice with a multiple of the lethal dose of the wildtype strain. Before L. monocytogenes may be used as a vector for the somatic gene therapy of cystic fibrosis, it has to be reengineered to target lung epithelial cells.

In der vorliegenden Arbeit wurde das Modell der Listerieninfektion in der Lunge der Maus nach intratrachealer (i.t.) sichtkontrollierter Instillation etabliert. Zur Bestimmung einer probaten Applikationsmethode wurde zunächst ein methodischer Vergleich verschiedener Applikationstechniken durchgeführt, bei dem die i.t. sichtkontrollierte Instillation als die am besten geeignete Methode beurteilt wurde (MUNDER et al., 2002). Da es bei der Verteilung einer i.t. applizierten Listeriensuspension nicht zu signifikanten Unterschieden der Keimzahlen in beiden Lungenhälften kam, wurde bei den folgenden Experimenten jeweils die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die rechte Lunge für die histologische Präparation verwendet. Wie der Vergleich zwischen der intragastrischen (i.g.) und der i.t. induzierten Listerieninfektion zeigte, konnte einerseits die pulmonale Kontamination nach i.g. Applikation der Bakterien nicht ausgeschlossen werden, andererseits fand nach i.t. Applikation eine rasche Dissemination aus der Lunge statt, so dass die Lunge nicht als Kompartiment gesehen werden konnte, welches eine Ausbreitung der Listerien verhindert. Wie aus der Literatur bekannt, besitzen die Mausinzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 unterschiedliche Suszeptibilitäten für eine parenterale Infektion mit L. monocytogenes EGD. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass BALB/c- und DBA/2-Mäuse für die i.t. Infektion ebenso suszeptibel sind wie für die parenterale und C57BL/6-Mäuse sich für beide Infektionsarten als resistent erweisen. Die i.t. Infektion der drei genannten Mausstämme mit dem attenuierten Bakterienstamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP ließ dagegen keine Unterschiede in der Suszeptibilität der Tiere erkennen. Die Virulenz der Bakterien war zudem stark abgeschwächt, so dass in Versuchen zur Bestimmung der Pathogenität die Infektionsdosis im Vergleich zur LD50 des Wildtypstamms um den Faktor 103 erhöht werden konnte, ohne dass es zu letalen Infektionsverläufen kam. Die untersuchten Infektionskinetiken der Organe Lunge, Milz, Leber und Gehirn unterschieden sich dabei nicht grundsätzlich von denen des Wildtypstamms L. monocytogenes EGD und wiesen auch keine dosisabhängigen Unterschiede auf. Die Charakterisierung des frühen Infektionsverlaufs nach i.t. Infektion zeigte eine relativ geringe Keimbelastung der Organe Milz, Leber und Gehirn, so dass die ersten 18 Stunden für mögliche Transfektionen mit Listerien interessant wären. Auch pathohistologische nachweisbare Entzündungszeichen wurden verstärkt nach diesem Zeitraum beobachtet und stellten sich als vorwiegend peribronchioläre und perivaskuläre Infiltrationen mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten dar. Für die Verwendung als Vektoren einer somatischen Gentherapie für die Cystische Fibrose ist die Invasion pulmonaler Epithelzellen durch die Listerien unabdingbare Voraussetzung. In der Arbeit wurde daher ein breites Spektrum histologischer Methoden angewandt, um die genaue Lokalisation der Listerien in der Lunge zu bestimmen. Trotz der Untersuchung verschiedener Infektionsdosen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion konnten intraepitheliale Bakterien des Stamms L. monocytogenes EGD nur singulär und nicht sicher reproduzierbar nachgewiesen werden. Obwohl KRUSCH et al. (2002) mit dem Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in vitro gute Transfektionsergebnisse beobachteten, zeigten sich die attenuierten Listerien in dieser Arbeit nicht in der Lage, Epithelzellen der Lunge zu infizieren. Mit der i.t. sichtkontrollierten Instillation steht nun eine nicht-invasive Methode zur Verfügung, mit der sich die Infektion in der Lunge der Maus reproduzierbar erzeugen lässt. Die herabgesetzte Virulenz des Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP ermöglicht die pulmonale Infektion suszeptibler Mäuse mit einem Vielfachen der LD50 des Wildtypstamms. Um eine Verwendung des Bakteriums L. monocytogenes als Vektor einer somatischen Gentherapie für die CF zu ermöglichen, muss ein Targeting der Bakterien auf epitheliale Zielzellen der Lunge erfolgen.

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Munder, Antje: Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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