Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG in vitro

Röhker, Claudia

Little is known about mechanisms giving obligate aerobe M. tuberculosis the ability to persist and replicate under oxygen-restricted and anaerobic conditions. In this study the arcA-(arginine-deiminase-) annotated gene of M. tuberculosis and M. bovis BCG was examined under aerobic and anaerobic conditions by constructing arcA-knock-outs. Arginine deiminase is the first of three ADI-Pathway encoding enzymes, giving Pseudomonas aeruginosa the capacity to grow under anaerobic conditions. To prove this first enzymatic step in which L-Arginine was degraded to citrulline and ammonia, the amount of produced ammonia was used as an indicator. An ammonia test was adapted for measuring the amount of produced ammonia. In the presence of ammonia, 2-oxoglutarate reacts to L-glutamate whereby NADH is oxidized. The amount of NADH oxidized is stochiometric to the amount of ammonia and can be measured photometrically and can be used to calculate the amount of produced ammonia. After failing in producing correct sequence amplificates by site-directed-mutagenesis, arcA-knock-outs (lacking 552 bp in arcA) were constructed by cloning and subsequent homologous recombination. The mutants showed significantly reduced ammonia production. In complemented mutants no difference to wildtype ammonia production could be detected. It can be presumed that arcA is indeed encoding for Arginindeiminase in M. tuberculosis and M. bovis BCG and is expressed in vitro.

Die Mechanismen, die es dem obligat aeroben M. tuberculosis ermöglichen, im mikroaerophilen bis anaeroben Milieu des menschlichen Organismus zu persistieren und sich im Makrophagen zu vermehren, sind nicht vollständig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob M. tuberculosis und M. bovis BCG das als Arginindeiminase (arcA) annotierte Gen nutzen, um unter anaeroben Bedingungen zu wachsen. Das bei diesem ersten enzymatischen Schritt, der L-Arginin zu Citrullin und Ammoniak abbaut, anfallende Stoffwechselprodukt Ammoniak wurde als Indikator der Reaktion verwendet. Ein Ammoniaktest wurde etabliert, um unter den Vesuchsbedingungen den Ammoniakgehalt zu messen. Der Test beruht auf der enzymatischen Reaktion von 2-Oxoglutarat zu L-Glutamat in Anwesenheit von Ammoniak, wobei die gleichzeitige Oxidation von NADH zu NAD+ photometrisch bestimmt wird. Mittels des Extinktionskoeffizienten lässt sich der Ammoniakgehalt errechnen. Nachdem es nicht gelang, mittels Site-directed-mutagenesis eine ablesefehlerfreie Deletion herbeizuführen, wurden mittels Klonierung und nachfolgender homologer Rekombination  Mutanten von M. tuberculosis und M. bovis BCG erstellt, die eine Deletion (552 bp) im arcA-Gen aufweisen. Die Ammoniakproduktion der Mutanten war im Funktionsassay deutlich vermindert. Eine Komplementierung der Mutante führte im Assay zu mit dem Wildtyp identischen Ammoniakgehalten. Es kann demnach davon ausgegangen werden, dass das arcA-Gen in M. tuberculosis und     M. bovis BCG tatsächlich für die Arginindeiminase kodiert und in vitro exprimiert wird. 

Zitieren

Zitierform:

Röhker, Claudia: Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG in vitro. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export