Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver Antikörper bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes

Rösner, Karen

Due to new therapeutic strategies and increasing life expectancy of domestic animals living in the care of humans, the veterinary oncology gained great importance during the last years, with special respect to the dog. Great efforts are made in order to improve diagnostic tests for tumors. Nevertheless, there is still a lack of easily accessible serological tumor markers. In humans, autoantibodies are frequently observed in sera of tumor patients. These antibodies can be used for early detection of a neoplastic condition and for prognosis, as there is a relation of their occurrence to the patients outcome. In the present study we prooved the hypothesis whether circulating autoantibodies are of diagnostic relevance in dogs affected by a tumor. Initially the attention was focussed on antinuclear antibodies (ANA) which represent the majority of autoantibodies detected in human patients suffering from neoplastic diseases. The study included sera of 314 canine tumor patients, of 46 healthy dogs and 40 dogs with mainly inflammatory diseases. Analyzing the sera in the standard immunofluorescence assay on slides (FARA) revealed that occurrence of ANA is a rare phenomenon among canine tumor patients as compared to humans. Mixed autoantibody populations with reactivity toward cytoplasmic and nuclear structures turned out to dominate in tumor affected dogs. The FARA proved to be insufficient for the reproducible detection of those antibodies due to subjective interpretation of results as shown by double blind studies. For this reason, an alternative method was developed based on flow cytometry which allowed for a standardized, objective and reproducible detection of these autoantibodies. As a drawback, only limited conclusions could be made with respect to the cellular localization of the fluorescence staining. Therefore the flow cytometric procedure should be combined with the conventional FARA method for initial screening assays. The occurrence of autoantibodies represented a frequent event in dogs with tumors, while the incidence of positive results differed strongly among the different types of tumors. In agreement with the findings in humans, autoantibody expression in dogs was mainly observed in patients with epithelial or hematological tumors, with emphasize on following tumors (the numbers in brackets indicate the incidence, which were significant higher as compared to healthy dogs [4%]): Leydig cell tumor (36%), squamous cell carcinoma (31%), malignant melanoma (29%), benign mixed mammary tumor (24%), and malignant lymphoma (20%). No correlation between autoantibody formation, sex, age or breed of the patients could be observed. The quantity of positive dogs in the group with predominantly inflammatory diseases amounted to 20%. Immunoblots revealed that autoantibodies found in canine tumor patients bind to a broad spectrum of nuclear and cytoplasmic antigens, which usually lack specifity for the underlying disease. This observation applied to single tumors, which were characterized by a heterogeneous autoantibody response, and to the entire tumor group compared to the control population (mainly inflammatory diseases), with exception of autantibodies to Ku, Scleroderma antigen (Scl-70) and mitochondrial antigens (M2). Autoantibodies with specificity for these proteins neither were detected in the control group of this study nor are they mentioned in canine systemic autoimmune diseases. Thus it can be taken into consideration that these autoantibodies are relevant for diagnosis of neoplastic diseases. It was shown by initial functional analyses that 14 (67%) of 21 autoantibody-positive sera mediated a cytotoxic effect on human and canine ex vivo cells and cultured cell lines. However, these effects seemed not to be mediated by antibodies, since toxicity did not persist with purified IgG preparations. In conclusion, these findings demonstrate that autoantibody formation does not occur in systemic autoimmune diseases only but also represents a frequent event in dogs suffering from neoplastic diseases. This pioneering study also demonstrates the relevance of more objective, flow cytometry-based assays for the initial autoantibody screening and the potential value of an antigen-specific detection system for differential diagnosis. The latter should be studied more intensively in the future. Moreover, emphasis should be placed on the pathophysiological role of autoantibodies, which may not be indicators of a disease only, but may be actively involved in disease pathogenesis.

Mit der Entwicklung neuer therapeutischer Möglichkeiten und der zunehmenden Lebenserwartung der in der Obhut des Menschen lebenden Haustiere hat die Onkologie in der Veterinärmedizin – insbesondere beim Hund – während der letzten Jahre eine große Bedeutung gewonnen. Dies wird von erheblichen Anstrengungen begleitet, die Diagnostik von Tumorerkrankungen zu verbessern, wobei es bislang an leicht zugänglichen serologischen Tumorindikatoren mangelt. Für den Menschen ist bekannt, dass in den Seren von Tumorpatienten autoreaktive Antikörper angetroffen werden, die zur Frühdiagnostik von Neoplasien und aufgrund der Korrelation zu klinischen Parametern zur Prognose herangezogen werden können. Für die vorliegende Promotionsarbeit galt es die Grundhypothese zu überprüfen, ob zirkulierende Autoantikörper bei caninen Tumorpatienten eine diagnostische Relevanz besitzen. Das Hauptaugenmerk war dabei zunächst auf antinukleäre Antikörper (ANA) gerichtet, die die die Mehrzahl der bei neoplastischen Erkrankungen des Menschen angetroffenen Autoantikörper repräsentieren. Für die Untersuchungen standen 314 Seren caniner Tumorpatienten, eine Vergleichsgruppe mit vorwiegend entzündlichen Erkrankungen (n = 40) und 46 gesunde Kontrolltiere zur Verfügung. Es zeigte sich anhand der Standardmethode zum Nachweis von ANA – ein fluoreszenzserologisches Verfahren mit mikroskopischer Auswertung (FARA) –, dass das Auftreten von reinen ANA bei den neoplastischen Erkrankungen des Hundes ein vergleichsweise seltenes Ereignis darstellte. In caninen Patientenseren dominierte ein gemischtes Autoantikörperrepertoire, das sich sowohl gegen zytoplasmatische als auch nukleäre Strukturen richtete. Der FARA erwies sich als ungeeignet zum reproduzierbaren Nachweis solcher Autoantikörper, da er, wie anhand von Doppelblindstudien dokumentiert werden konnte, zu sehr subjektiven Ergebnissen führte. Aufgrund dieser Problematik wurde ein durchflusszytometrisches Verfahren etabliert, welches eine objektive, standardisierbare und gut reproduzierbare Erfassung der Autoantikörper erlaubte. Aussagen über die zelluläre Fluoreszenzlokalisation waren mit diesem Verfahren allerdings nur sehr eingeschränkt möglich. Daher empfiehlt sich zum initialen Autoantikörper-Screening eine Kombination aus dem FARA und der durchflusszytometrischen Methode. Das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei den Tumorerkrankungen des Hundes stellte ein häufiges Ereignis dar, wobei die einzelnen Tumoren bezüglich der Frequenz autoantikörperpositiver Befunde deutlich differierten. So waren Autoantikörper insbesondere bei Patienten mit epithelialen und hämatopoetischen Tumoren anzutreffen, was mit den Beobachtungen beim Menschen im Einklang steht. Hervorzuheben sind die folgende Tumoren (die Zahl in Klammer gibt die Inzidenz seropositiver Befunde wieder, welche signifikant größer war als bei der gesunden Kontrollgruppe [4%]): Leydigzelltumor (36%), Plattenepithelkarzinom (31%), malignes Melanom (29%), benigner Mammamischtumor (24%) und malignes Lymphom (20%). Hinsichtlich des Vorkommens autoreaktiver Antikörper konnte keine statistisch gesicherte Geschlechts-, Alters- oder Rassendisposition festgestellt werden. In der Vergleichsgruppe mit vorwiegend entzündlichen Erkrankungen befanden sich 20% autoantikörperpositive Tiere. Anhand von Immunoblot-Analysen zeigte sich, dass die Autoantikörper caniner Tumorpatienten gegen ein breites Spektrum nukleärer und zytoplasmatischer Antigene gerichtet waren, die in der Regel eine Spezifität für die zugrundeliegende Erkrankung vermissen ließen. Dies galt gleichermaßen für einzelne Tumoren, die generell mit einer sehr heterogenen Autoantikörperantwort einhergingen, als auch für das Autoantikörperrepertoire, das bei der Gesamtheit der Tumorpatienten und Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen vorgefunden wurde. Eine Ausnahme stellten Autoantikörper dar, die mit dem Antigen Ku, dem Scleroderma-Antigen (Scl-70) oder mitochondrialen Antigenen (M2) reagierten. Diese wurden weder in den Seren der Vergleichsgruppe angetroffen, noch finden sie bei den systemischen Autoimmunerkrankungen des Hundes eine Erwähnung. Somit kann vorsichtig postuliert werden, dass diese Autoantikörper für die Diagnose von Tumorerkrankungen relevant sind. Mittels initialer Funktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass 14 (67%) von 21 autoantikörperpositiven Patientenseren zytotoxisch für humane bzw. canine ex vivo Zellen und Kulturzelllinien waren. Dieser zytotoxische Effekt schien jedoch nicht durch Antikörper vermittelt zu sein, da er mit aufgereinigten IgG-Präparationen nicht reproduziert werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Promotionsarbeit verdeutlichen, dass autoreaktive Antikörper nicht allein mit klassischen Autoimmunerkrankungen des Hundes einhergehen, sondern ebenso bei neoplastischen Erkrankungen anzutreffen sind. Diese Studie, die zweifelsohne den Charakter einer Pioneerarbeit hatte, dokumentiert die Bedeutung objektiver, durchflusszytometrischer Verfahren zum initialen Nachweis caniner Autoantikörper und den möglichen differentialdiagnostischen Wert eines Antigen-spezifischen Autoantikörpernachweises. Letzteres gilt es in Zukunft intensiver zu studieren und zudem der Frage einer pathophysiologischen Bedeutung der nachgewiesenen Autoantikörper nachzugehen, die nicht nur als Indikatoren einer Erkrankung angesehen werden können, sondern möglicherweise in der Pathogenese der Erkrankungen eine Rolle spielen.

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Rösner, Karen: Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver Antikörper bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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