Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Der molekulare Mechanismus der Nitratreduktaseaktivität von Mycobacterium tuberculosis

Stermann, Marion

With respect to vaccine development and novel drug targets, metabolic pathways of mycbacteria which could play an important role in pathogenesis, have been a major focus of research for the past years. Nitrate accumulates in tissue infected with mycobacteria. Reduction of nitrate to nitrite allows bacterial metabolism when oxygen is absent. The environment within grauloma is deprived of oxygen. Further reduction of nitrite to ammonia allows assimilation of nitrate and enables bacteria to grow on nitrate. Here, we used a genetic approach to study nitrate metabolism of M. tuberculosis. A deletion within narGHJI of M. tuberculosis was generated. The mutant was incapable of accumulating nitrite from nitrate under anaerobic conditions. Surprisingly, the mutant was also unable to grow on nitrate as a sole nitrogen source under aerobic conditions. Thus nitrate reductase encoded by narGHJI functions in the presence and absence of oxgen. The enzym mediates both nitrate respiration and nitrate assimilation. A mutation with a deletion within Rv1165, a gene of unknown function, which is located immediately downstream of narGHJI, was phenotypically similar to M. tuberculosis wild type. Thus Rv1165 does not play a role in nitrate metabolism in M. tuberculosis. M. tuberculosis strongly accumulates nitrite from nitrate, whereas M. bovis and the other members of the M. tuberculosis complex reduce little or no nitrate. Within the promoter of narGHJI, M. tuberculosis and M. bovis differ by a single nucleotide. At position –215 prior to the start codon of narG, M. tuberculosis contains a thymine residue, whereas M. bovis contains a cytosine residue. Here we demonstrate that the single nucleotide polymorphism (SNP) within the promoter of narGHJI is responsible for strong nitrate reductase activity of M. tuberculosis. Mutation of the narGHJI promoter at position –215 (TÕ C) in M. tuberculosis reduced nitrate reductase activity of the mutated strains to that of M. bovis. Assimilation of nitrate in M. tuberculosis remained unaffected by the mutation of the narGHJI promoter at position –215 (TÕ C).

Hinsichtlich der Entwicklung von neuen Impfstoffen und neuen "drug targets" rücken der Stoffwechsel und die daran beteiligten Gene von persistierenden Mykobakterien, speziell von M. tuberculosis, in den Blickpunkt des Interesses. In diesem Zusammenhang wurde der Nitratstoffwechsel unter anaeroben und aeroben Bedingungen untersucht. Über homologe Rekombination wurden zum einen Deletionsmutationen und zum anderen Punktmutationen in das für die anaerobe Nitratreduktase codierende narGHJI-Operon von M. tuberculosis eingeführt. Die entstandenen Mutanten wurden über Wachstumskurven und in verschiedenen Nitratreduktaseexperimenten, in denen jeweils nur Nitrat als Stickstoffquelle angeboten wurde, phänotypisch charakterisiert. Die Deletionen betrafen den Promotorbereich von narGHJI, das narG-Gen oder das Gen Rv1165, das unmittelbar an das narGHJ-Gencluster grenzt und dessen Funktion unklar ist. Die Promotor- und die beiden narG-Deletionsmutanten konnten - im Gegensatz zu dem M. tuberculosis Wildtyp - unter anaeroben Bedingungen kein Nitrat zu Nitrit reduzieren. Im aeroben Milieu konnten sich die Mutanten – überraschenderweise - nicht wie der M. tuberculosis Wildtyp vermehren. Die Nitratreduktase NarGHJI hat demnach zwei unterschiedliche Funktionen: die Respiration unter anaeroben Bedingungen und die Assimilation unter aeroben Verhältnissen. Die D Rv1165-Mutante zeigte in allen Experimenten den Phänotyp von M. tuberculosis und hat somit zumindest in-vitro keine Funktion innerhalb der durch NarGHJI vermittelten Nitratreduktion. Vergleiche der Nitratreduktaseaktivität zwischen den Spezies des M. tuberculosis-Komplexes zeigen, dass M. tuberculosis im Gegensatz zu M. bovis und M. bovis BCG Nitrit aus der Nitratreduktion stark akkumuliert. Genotypisch ist im Promotorbereich 215 bp vor dem Start des narG-Gens der genannten Spezies ein T-C-Polymorphismus vorhanden: M. tuberculosis besitzt die Base Thymin, während M. bovis und M. bovis BCG über die Base Cytosin verfügen. Der Austausch der Base Thymin gegen Cytosin im M. tuberculosis Genom bewirkte eine deutliche Abschwächung der Nitratreduktaseaktivität, die nun auf dem Niveau von M. bovis liegt. Der Einzelnukleotidpolymorphismus im Promotorbereich von narGHJI ist für die unterschiedlich starke Nitratreduktaseaktivtät zwischen M. tuberculosis und M. bovis verantwortlich. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Nitratreduktase NarGHJI unter anaeroben Bedinungen eine respiratorische und in einer aeroben Umgebung assimilatorische Funktionen ausübt. Genauere Untersuchungen zum narGHJI-Promotor legen dar, dass die respiratorische Funktion von einer einzigen Base im Promotorbereich beeinflusst wird.

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Stermann, Marion: Der molekulare Mechanismus der Nitratreduktaseaktivität von Mycobacterium tuberculosis. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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