Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Construction and characterization of genetically defined metabolic mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae

Sunn, Kyaw

Actinobacillus pleuropneumoniae is a major threat to the swine industry due to the pathogen's ability to persist in host tissues even after vaccination with widely used bacterins, and due to the lack of cross-serotype protection. Since natural infection can provide cross-serotype protection, an attenuated live marker vaccine strain may be a useful tool. Parts of the genes encoding a putative [NiFe] hydrogenase 2 subunit (hybB) and the L-fuculose 1-phosphate aldolase (fucA) were identified from a substracted A. pleuropneumoniae AP76 cDNA library obtained after induction of A. pleuropneumoniae cultures with BALF from animals infected with A. pleuropneumoniae. For further analyses, large fragments containing the entire genes were isolated from a genomic library by hybridizing with the cDNA fragments as probes. Nucleotide sequencing analyses of one fragment, designated as RN400, revealed a complete ORF encoding the entire [NiFe] hydrogenase 2 (hybB). In a BLAST search on the incomplete genomic sequence of A. pleuropneumoniae serotype 7 with the A. pleuropneumoniae AP76 hybB ORF, a putative hybABCDEFG operon was identified; the putative A. pleuropneumoniae HybA protein contains a recognition sequence for the twin arginine translocation (TAT) pathway. The second fragment, designated as RN402, contained three complete ORFs as assessed by nucleotide sequence analysis. These ORFs encode a putative L-fuculose 1-phosphate aldolase (fucA), an L-fucose permease (fucP), and an L-1,2 propanediol oxidoreductase (fucO) respectively. Based on hypothesis that adaptation of A. pleuropneumoniae to anaerobic conditions, as they occur in necrotic lung lesion, may play role in A. pleuropneumoniae virulence and persistence in the host, two isogenic mutants with a deletion in the hybB and the fucO gene, respectively, were constructed and examined in an aerosol infection model. The A. pleuropneumoniae mutant with a deletion in the fucO gene remained fully virulent in the challenge experiment, implying that the L-1,2 propanediol oxidoreductase is not required for virulence in A. pleuropneumoniae. The deletion mutant A. pleuropneumoniae D hyb was shown to be slightly attenuated in acute disease. Therefore, the hybB deletion may be useful for the construction of a live vaccine strain carrying multiple deletions.

Die Fähigkeit von A. pleuropneumoniae zur Persistenz im Wirtsorganismus selbst bei geimpften Schweinen stellt ein besonderes Problem bei der Bekämpfung der Actinobacillus-Pleuropneumonie dar. Da die natürliche Infektion Persistenz verhindern und gleichzeitig eine belastbare Kreuzimmunität auslösen kann, erscheinen Lebend-Markerimpfstämme, denen Gene fehlen, die sie zur Persistenz befähigen, als ein möglicher Weg zur Bestandssanierung. Ein Teil des [NiFe] Hydrogenase 2 kodierenden Gens (hybB) und ein Teil des L-Fuculose 1-Phosphat Aldolase Gens (fucA) wurden bei einem differenziellen Screening aus einer Expressionsgenbank identifiziert, die von A. pleuropneumoniae nach Zusatz von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) zum Kulturmedium exprimiert werden. Für weitere Analysen wurden grössere Fragmente aus einer Genbank isoliert. Bei der Analyse dieser DNA-Sequenzen zeigte das erste Fragment einen vollständigen offenen Leserahmen (ORF), der für die ganze [NiFe] Hydrogenase 2 (HybB) kodierte. In der BLAST Suche auf unvollständige genomische Sequenzen von A. pleuropneumoniae mit diesem ORF wurde ein hybABCDEFG Operon identifiziert. Das vermutliche A. pleuropneumoniae HybA-Protein enthält eine Signialpeptid Sequenz für den "twin-arginine translocation (TAT) pathway". Das zweite Fragment enthielt drei vollständiger ORFs. Die ORFs kodieren die vermutliche L-Fuculose 1-Phosphat Aldolase (FucA), die L-Fucose Permease (FucP) und die L-1,2 Propanediol Oxidoreduktase (FucO). Basierend auf der Hypothese, dass eine Beeinträchtung des anaeroben Stoffwechsels die Vermehrung von A. pleuropneumoniae im Tier verlangsamen und möglicherweise die Persistenzfähigkeit reduzieren könnte, wurden zwei isogene Mutanten mit einer Deletion im hybB und fucO Gen konstruiert und in einem Aerosolinfektionsmodell überprüft. A. pleuropneumoniae mit einer Deletion im fucO Gen war im Belastungversuch nicht attenuiert. Die Deletionsmutante A. pleuropneumoniaeD hyb zeigte sich leicht attenuiert; insbesondere war die Erhöhung der Körpertemperatur bei den infizierten Tieren signifikant geringer als bei den Kontrolltieren. Somit könnte eine hybB-Deletion in Kombination mit anderen bereits bekannten Deletionen in virulenzassoziierten Genen bei der Konstruktion eines Markervakzinestamms von Nutzen sein.

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Sunn, Kyaw: Construction and characterization of genetically defined metabolic mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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