Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen im Modell der Interleukin-10 defizienten Maus

Bleich, André

Inflammatory bowel disease (IBD) in humans encompasses a heterogeneous collection of chronic inflammatory conditions, including Crohns´s disease and ulcerative colitis. Development of IBD entails complex and as-yet poorly understood interactions between the genetic and physical environments. Interleukin-10 (IL10) deficient mice (Il10tm1Cgn) serve as an animal model for human IBD. In this model system, the severity and course of the intestinal inflammation strongly depend on the genetic background strain of the mice carrying the disrupted Il10 gene: The C3H/HeJBir strain is highly susceptible to the disease, whereas the C57BL/6J strain confers resistance. In previous studies, genome wide scans with microsatellite markers were performed on segregating backcross and F2 populations resulting in ten colitogenic QTLs. A major colitogenic QTL was identified on Chromosome 3 (MMU3) at 70 cM. Aims of this study were finemapping of the MMU3 QTL and confirming its effect by means of congenic animals and to determine the role of two possible candidate genes, Nfkb1 and Fabp2, which are localized in the chromosomal region identified by finemapping. Another aim was to identify candidate genes within the QTL intervals, which likely contribute to colitis susceptibility. Therefore, we analyzed gene expression patterns in colonic tissue of colitis susceptible and resistant strains and combined the results with previous QTL mapping data. Finemapping of the main QTL using IL10 deficient animals of a segregating backcross population [(C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn x C57BL/6J-Il10tm1Cgn)F1 x C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn]N2 revealed two markers associated with severity of IBD, as determined by histology: D3Mit199 (MMU3, 60.5 cM) and D3Mit257 (MMU3, 70.3 cM). Both markers interacted with markers on MMU12 (38 and 50 cM). The colitogenic effect of the MMU3 peakmarkers was confirmed by using congenic animals, in which a region of MMU3 containing the main QTL was backcrossed from the colitis susceptible to the resistant strain and vice versa. All congenic elements with colitogenic effects spanned a region on MMU3 between approximately 63 and 84 cM. Based on their location within the QTL interval on MMU3 and on their immune function, two candidate genes, Nfkb1 and Fabp2, were chosen to evaluate their role as colitis modifying genes. Candidate gene analyses were performed by sequencing both genes in colitis susceptible C3H/HeJBir and resistant C57BL/6J strains as well as measuring their expression on the RNA level (real-time PCR) and protein level (electrophoretic mobility shift assays with Nfkb1 and immunohistochemistry for Fabp2, respectively). None of this analyses revealed any strain specific differences which could support the role of Nfkb1 and Fabp2 as colitis modifying genes in this mouse model. Out of the approximately 12,500 genes and ESTs on the Affymetrix GeneChip, 1% showed different expression levels in colonic tissue of IL10 deficient C3H/HeJBir and C57BL/6J mice. We were able to select 20 genes as candidate genes due to their location within a QTL interval and their function in immune response. By comparing the expression of these 20 genes also in the background strains with wildtype Il10 alleles, an effect of the genetic background on the expression levels of three genes was appearent. Therefore, these genes (Gbp1, Cd14, Pla2g2a) were considered to be major candidate genes. The most striking one is Gbp1, because it is localized in the interval of the main QTL on MMU3, is among the most abundant proteins in IFNγ stimulated cells, and is already known to be polymorphic between different mouse inbred strains. Gbp1 is inducible in C3H/HeJ mice while it is refractory in C57BL/6J mice. In future studies, the relevance of Gbp1 to colitis susceptibility should be determined, e.g. using genetically engineered mice. Furthermore, the number of most likely candidate genes could be reduced by further breeding congenic animals carrying further constricted congenic elements.

Es gibt deutliche Hinweise, daß die Ätiopathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) des Menschen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, durch genetische Faktoren bestimmt wird. Für die Untersuchung dieser Faktoren, die sich in den heterogenen menschlichen Populationen als schwierig erwiesen hat, stehen eine Reihe von Tiermodellen zur Verfügung, z.B. die Interleukin-10 (IL10) defiziente Maus (Il10tm1Cgn). Bei diesem Tiermodell hängt die Ausprägung der Erkrankung unter gleichen Haltungsbedingungen entscheidend von dem Hintergrundstamm ab, auf den die Nullmutation eingekreuzt wurde. Daraus läßt sich schließen, daß weitere genetische Faktoren die CED-Suszeptibilität modulieren. So erkranken IL10 defiziente Mäuse, bei denen der Inzuchtstamm C3H/HeJBir den genetischen Hintergrund bildet, wesentlich schwerer als IL10 defiziente Mäuse auf einem C57BL/6J Hintergrund. Durch genomweite Kopplungsanalysen an Kreuzungspopulationen, die für die Allele der IL10 defizienten C3H/HeJBir und C57BL/6J Stämme segregierten, wurden 10 chromosomale Regionen mit CED-modulierenden Suszeptibilitätsloci (QTL, "quantitative trait loci") identifiziert, wovon ein QTL auf Maus-Chromosom (MMU) 3 herausragte. Ziele dieser Arbeit waren die Feinkartierung dieses QTLs und die Überprüfung seines kolitogenen Effekts mit Hilfe von kongenen Tieren sowie die Untersuchung zweier attraktiver Kandidatengene, Nfkb1 und Fabp2, die sich hierbei aus positioneller und funktioneller Sicht ergaben. Außerdem sollte die Expression von Genen im Kolon der CED-suszeptiblen und -resistenten Tiere mittels Microarrays verglichen und mit den Kopplungsanalysen aus den Vorarbeiten kombiniert werden, um kolitogene Kandidatengene innerhalb der 10 QTL-Intervalle zu identifizieren. Bei der Feinkartierung des QTLs an IL10 defizienten Tieren einer segregierenden Rückkreuzungspopulation auf den kolitissuszeptiblen Stamm C3H/HeJBir [(C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn x C57BL/6J-Il10tm1Cgn)F1 x C3H/HeJBir-Il10tm1Cgn]N2 zeigten die Marker D3Mit199 (MMU3, 60,5 cM) und D3Mit257 (MMU3, 70,3 cM) die höchste Assoziation zu der Ausprägung der Darmentzündung, die im Zäkum und Kolon der IL10 defizienten Tiere histologisch bestimmt wurde. Darüber hinaus interagierten beide Marker mit Loci auf MMU12 (38 und 50 cM). Die Kopplungsbefunde für MMU3 wurden durch die Ergebnisse der kongenen Tiere bestätigt. Bei den kongenen Tieren handelte es sich um IL10 defiziente Mäuse auf einem C3H/HeJBir Hintergrund, bei denen ein Abschnitt des Chromosoms 3 mit dem Hauptsuszeptibilitätslocus von C57BL/6J Tieren eingekreuzt worden war, bzw. um IL10 defiziente Tiere auf einem C57BL/6J Hintergrund, die ein kongenes Chromosom 3 Element von C3H/HeJBir Tieren trugen. Den kongenen Elementen mit einem kolitogenen Effekt war ein Bereich auf MMU3 zwischen ca. 63 und ca. 84 cM gemeinsam. Zwei Kandidatengene, die sich auf MMU3 aus positioneller und funktioneller Sicht ergaben, waren Nfkb1 und Fabp2. Beide Kandidatengene wurden bei kolitisresistenten C57BL/6J und kolitissuszeptiblen C3H/HeJBir Tieren sequenziert und ihre Expression mittels real-time PCR und electrophoretic mobility shift assays (bei Nfkb1) bzw. Immunhistochemie (im Falle von Fabp2) verglichen. Keine der Untersuchungen konnte die Rolle von Nfkb1 und Fabp2 als kolitismodulierende Kandidatengene im IL10 defizienten Tiermodell stützen. Bei den Microarray-Analysen zeigten ca. 1% der auf dem Affymetrix GeneChip vertretenen Gene bzw. ESTs einen Expressionsunterschied im Kolon von IL10 defizienten C3H/HeJBir und C57BL/6J Mäusen. Von diesen Genen wurden 20 aufgrund ihrer Lokalisation innerhalb der QTL-Intervalle und ihrer Funktion im Immunsystem als Kandidatengene selektiert. Anschließend wurde die Expression dieser 20 Kandidatengene auch zwischen den jeweiligen Hintergrundstämmen mit den Il10-Wildtypallelen verglichen. Bei drei der Kandidatengene ließen die Expressionsunterschiede bei IL10 defizienten Tieren und Mäusen des entsprechenden Hintergrundstamms auf einen Effekt des genetischen Hintergrundes auf das Expressionsniveau schließen. Diese drei Gene, Gbp1 (MMU3), Cd14 (MMU18) und Pla2g2a (MMU4) wurden als Hauptkandidaten selektiert. Das wichtigste Kandidatengen ist Gbp1, da es auf MMU3 in dem Bereich mit dem Hauptsuszeptibilitätslocus lokalisiert ist, zu den am häufigsten vorkommenden Proteinen in IFNγ-stimulierten Zellen gehört und bereits ein Polymorphismus zwischen verschiedenen Mausinzuchtstämmen bekannt ist. So gehören C3H/HeJBir Mäuse zu der Gruppe von Inzuchtstämmen, die das das Protein exprimieren können, während dieses Protein bei C57BL/6J Mäusen nicht durch IFNγ induziert wird. In nachfolgenden Arbeiten sollte mittels gentechnisch veränderter Mäuse untersucht werden, ob diese Stammesunterschiede hinsichtlich des Gbp1-Gens auch von relevanter Bedeutung für die Darmhomöostase sind und ob Gbp1 der gesuchte suszeptibilitätsvermittelnde Faktor ist. Darauf aufbauend könnte die pathogenetische Bedeutung dieses Faktors oder des Signalweges, in dem er von Bedeutung ist, bei der humanen CED überprüft werden. Daneben stellt die Zucht weiterer kongener Tiere eine Möglichkeit dar, den Suszeptibilitätslocus auf MMU3 möglichst weit einzugrenzen, um das Kandidatengen zu identifizieren.

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Bleich, André: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen im Modell der Interleukin-10 defizienten Maus. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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