Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor-Liganden

Dahnke, Julia

Immune cells recognize Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) with Toll-like-receptors. Examples for members of this heterogeneous group of PAMPs are the lipopolysaccharide of Gram negative bacteria, the lipoteichoic acid of Gram positive bacteria as well as non-methylated DNA sequences containing a central CG dinucleotide (CpG motifs). In this study it was evaluated, whether and how bovine immune cells (lymphocytes, in vitro generated macrophages and granulocytes) are modulated by different PAMPs, especially by different CpG-motifs. Membrane fluorescence studies under amplifying conditions utilizing a biotinylated CpG and GpC motif could show that DNA motifs have binding sites on all investigated cell populations (lymphocytes, monocytes, neutrophils and eosinophils). The binding capacity for DNA motifs differed between the cell types as well as within a distinct cell population. The CpG motif bound stronger to a subpopulation of MHC class II positive B cells compared to the reverse GpC motif. Intracellular fluorescence assays proved, that internalization of DNA motifs occurs rapidly already beginning after 5 minutes of incubation. Compared to a potent stimulus (superantigenSEA), CpG motifs induced only a weak (although significant) proliferative response of blood mononuclear cells (MNC). Combined stimulation of MNC with SEA and CpG motifs resulted in an additive effect. CpG stimulation of bovine lymphocytes resulted also in an enhanced MHC class II expression. None of the studied PAMPs (CpG motifs, LPS, LTA) clearly affected the viability of pure bovine neutrophilic granulocytes: compared to controls, 90% of stimulated granulocytes remained viable. However, in co-cultures of PMN and freshly isolated MNC, the addition of the PAMPS (except LTA) resulted in a loss of neutrophil viability. The percentages of remaining viable neutrophils ranged between 64% and 85% after stimulation with CpG motifs, (52%±20) after stimulation with SEA, (76%±24) due to LPS stimulation and 96%±26 after stimulation with LTA. Differences between distinct CpG motifs were not observed. The combined stimulation of PMN/MNC co-cultures with CpG motifs and other stimuli (SEA, LPS or LTA) resulted in an additive effect. Using the most potent stimulus combination (SEA+CpG 2007) the remaining viability of neutrophils was 28%. Killing of granulocytes was selective for neutrophils, eosinophils remained unaffected. Direct cell interactions between PMN and MNC were not necessary for the killing of neutrophils since culture supernatants of stimulated MNCs induced the same degree of neutrophil viability loss. To study the interaction of PAMPs with in vitro generated macrophages, first an alternative method to generate macrophages from blood monocytes was established. The method using cell culture flasks proved to be more efficient compared to the usage of teflon bags and resulted in the generation of macrophages with comparable morphological, phenotypical and functional properties. The flow cytometric determination of nitric oxide generation on single cell level using the fluorochrome DAF-2 DA showed, that CpG motifs only slightly induce NO generation in bovine macrophages. However, stimulation of macrophages with  PAMPs also resulted in a very efficient killing of simultaneously present neutrophils. Comparisons between autologous (PMN and MNC/macrophages from the same animal) and allogeneic (PMN and MNC/macrophages from different animals) stimulation assays showed, that killing of neutrophils is also governed by the physiological status of PMN. This doesn’t seem to be regulated by either progesterone or estrogen since the cycle stage of an animal had no apparent influence on the degree of losing viability among neutrophils. The PAMP-mediated, viability-depressing effect for neutrophils generally appears to be induced by a large variety of pathogen associated patterns. This may reflect an advantageous mechanism induced by pathogens, which eliminates effector cells directed against them. It may also be that this observed phenomenon is a reaction of the infected host, which protects it from tissue damage by to many activated neutrophilic granulocytes.

Zellen des Immunsystems erkennen über Toll-like-Rezeptoren Molekulare Muster von Erregern (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Zu der heterogenen Gruppe der PAMPs gehören Moleküle wie das LPS Gram negativer Keime, die Lipotei­chonsäure Gram positiver Bakterien sowie nichtmethylierte DNA-Sequenzen mit einem CG-Dinukleotid im Zentrum (CpG-Motive). In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob und in welcher Weise Zellen des bovinen Immunsystems (lymphoide Zellen, in vitro generierte Makrophagen und Granulozyten) durch verschiedene PAMPs, insbesondere CpG-Motive moduliert werden. Mit Hilfe eines biotinylierten CpG- und eines GpC-Motivs konnte in der Membran­fluoreszenz nach Einsatz eines amplifizierenden Systems gezeigt werden, dass DNA-Motive Bindungsstellen auf allen untersuchten Zellpopulationen besitzen (Lympho­zyten, Monozyten, neutro­phile und eosinophile Granulozyten sowie Makrophagen). Die Bindungskapazität unterschied sich sowohl zwischen den Zellpopulationen als auch innerhalb einer bestimmten Zellpopulation. Das CpG-Motiv band stärker an eine Subpopulation MHC-Klasse-II positiver B-Zellen als das reverse GpC-Motiv. Mit Hilfe der intrazellulären Fluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass eine Internalisierung der DNA-Motive bereits nach 5-minütiger Inkubation boviner Zellen stattfindet. Die von CpG-Motiven induzierte, durchflusszytometrisch erfasste Blastogenese von lymphoiden Zellen erwies sich gegenüber einem potenten Stimulus (Superantigen SEA) als schwach aber signifikant. Der kostimulatorische Einsatz von CpG-Motiven und SEA erwies sich als additiv. Die Stimulierung boviner lymphoider Zellen durch CpG-Motive in vitro führte zu einer gesteigerten MHC-Klasse-II-Expression. Keines der untersuchten PAMPs (CpG-Motive, LPS und LTA) besaß einen markanten Einfluss auf die Vitalität eosinophiler oder neutrophiler Granulozyten in reinen PMN-Kulturen. Der Vitalitätsverlust lag bei der Stimulation durch jeweils einen Stimulus bei maximal 10%. In Kokulturen von PMN und frisch isolierten MNC konnte durch alle untersuchten Stimuli mit Ausnahme des LTA ein Vitalitätsverlust der Neutrophilen induziert werden. Die signifikant erniedrigten Restvitalitäten (im Vergleich zur Mediumkontrolle) neutrophiler Granulozyten betrugen nach Stimulation mit einzelnen CpG-Motiven zwischen 64% und 85%, nach Stimulation mit dem Superantigen SEA (52%±20) mit LPS (75%±24) und mit LTA 96%±26. Unterschiede zwischen verschiedenen CpG-Motiven konnten ebenfalls nicht festgestellt werden. Bei kombiniertem Einsatz von CpG-Motiven mit anderen Erregermustern (dem Superantigen SEA, dem LPS oder dem LTA) addierten sich die Vitalitätsmindernden Effekte der Einzelstimuli. Bei Verwendung der potentesten Stimuluskombination betrug die Restvitalität der neutrophilen Granulozyten 28%. Das PAMP-induzierte Sterben der Granulozyten erwies sich als selektiv für neutrophile Granulozyten, die Vitalität eosinophiler Granulozyten blieb unbeeinflusst. Für den Vitalitätsverlust waren hauptsächlich die von MNC sezernierten löslichen Faktoren verantwortlich, da durch Inkubation der PMN mit Kulturüberständen stimulierter MNC einen vergleichbaren Vitalitätsverlust aufwiesen. Um die Interaktion von PAMPs mit in vitro generierten Makrophagen zu untersuchen, wurde ein Alternativverfahren zur Generierung dieser Zellen aus Monozyten des peri­pheren Blutes etabliert. Das Verfahren unter Verwendung von Zellkulturflaschen erwies sich als effizienter als das Verfahren in Teflonbeuteln (bei vergleichbaren morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der generierten Makrophagenpopulationen) und wurde für die nachfolgenden Versuche vorgezogen. Nach Etablierung einer durchflusszytometrischen Methode zur Erfassung der Stickoxid­bildung auf Einzelzellebene mit Hilfe des NO-sensitiven Fluorochroms DAF-2 DA zeigte sich, dass CpG-Motive allenfalls eine schwache NO-Bildung von Makrophagen induzierte. PAMP-stimulierte Makrophagen führten hingegen in sehr effizienter Weise ebenfalls zu einem selektiven Vitalitätsverlust von neutrophilen Granulozyten in Kokulturen aus Makrophagen und PMN. Der Vergleich autologer (PMN und MNC/Makrophagen vom selben Tier) mit allogenen Stimulationsansätzen (PMN und MNC/Makrophagen von verschiedenen Tieren) belegte, dass neben der Stimulierbarkeit der MNC/Makrophagen ebenso die indivi­duelle Reaktionslage der PMN mitentscheidend für den indirekt induzierten Zelltod der neutrophilen Granulozyten ist. Letztere scheint zumindest nicht Progesteron-/Östrogengesteuert zu sein, da der Zyklusstand eines Tieres keinen erkennbaren Einfluss auf die Reaktionsbereitschaft der neutrophilen Granulozyten erkennen ließ. Der PAMP-vermittelte, Vitalitäts-mindernde Effekt für neutrophile Granulozyten scheint generell durch verschiedenste Erregermuster durch Stimulation von MNC und Makrophagen induziert zu werden. Dies kann für den pathogenen Organismus einen Vorteil darstellen, da er über seine Erregermuster Effektorzellen eliminiert. Ebenso bleibt denkbar, dass dieses Phänomen eine Schutzreaktion des Wirtes gegen zu viele und zu stark aktivierte neutrophile Granulozyten darstellt.

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Dahnke, Julia: CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor-Liganden. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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