Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein

Hölker, Michael

The aim of the present study was to establish a protocol for porcine somatic cell cloning and to produce viable piglets from reconstructed embryos transferred to synchronized gilts. In vitro matured oocytes out of slaughterhouse ovaries were used as starting material for all experiments. The criteria for evaluating each protocol were the number of nuclei found at specific developmental stages,  blastocyst morphology, and, in some cases, the fusion rate.   In the first set of experiments, a parthenogenetic model was used for rapid evaluation of protocols for maintaining matured oocytes in culture and activating them by electrical stimulation and DMAP. The result of this work was the establishment of a standard protocol which permitted the storage of embryos for periods up to 7.5 hours without degradation. This was necessary in order to provide enough time to carry out subsequent steps of the nuclear transfer procedure. This set of experiments also permitted the optimization of the activation procedure to get a high cleavage rate and a high percentage of parthenogenetic embryos reaching the blastocyst stage. In the second set of experiments, a nuclear transfer protocol was developed which gave a satisfactory percentage of reconstructed embryos reaching the blastocyst stage during in vitro culture. This was accomplished by optimization of fusion efficiency (fusion rate) and by varying the duration of maturation while monitoring the number of nuclei at each developmental stage and blastocyst morphology. In the third phase of this work, the viability of the embryos produced by the nuclear transfer protocol was confirmed by transfer of activated zygotes to synchronized gilts. This resulted in the birth of two viable piglets.   The following results were obtained:   1.         Using a standard two step maturation protocol, 71% of all oocytes maintained in the maturation medium reached the metaphase II stage after 44 hours in culture, as evaluated by Hoechst staining.    2.         In experiments with parthenogenetic embryos, the optimal electric field strength for a fixed pulse duration of 45 µsec was 1.0 KV/cm.  With this combination, 72.9% of all activated oocytes cleaved and 29.6% of the activated oocytes reached the blastocyst stage. Other field strengths (1.25 KV/cm, 1.5 KV/cm, and 1.75 KV/cm) gave significantly lower cleavage (72.9% vs. 60.5% vs. 25.9% vs. 13.8%) and blastocyst rates (29.6% vs. 12.9% vs. 4.3% vs. 0%). The difference between the 0.8 KV/cm group and the 1.0 KV/cm group was not significant.   3.         Again using parthenogenetic embryos, the standard one step NCSU23 culture system gave significantly higher cleavage rates than a three step culture system consisting of: sequential use of 1) cr2 for 48 hours; 2) NCSU23+BSA for 48 hours; and 3) NCSU23+FCS for 72 hours (62.9% vs. 54.7%).   4.         Storage of oocytes for 7.5 hours before activation in TL-Hepes resulted in a significantly higher number of nuclei at blastocyst stage than storage in Hb-NCSU23 (22.3%  vs. 18.7%).    5.         In a further experiment with parthenogenetic embryos, storage over 7.5h  in TL-Hepes with an osmolarity of 296 mOsmol or 321 mOsmol gave significantly higher blastocyst rates after activation than storage in TL-Hepes with an osmolarity of 271 mOsmol (18.3% vs. 24.4-26.2%).   6.         In a comparison between electrostimulation alone and the combination of electroactivation followed by a second stimulation with 6-DMAP; the two step combination gave a significantly higher rate of blastocyst formation (40.4% vs. 26.5%).    7.         In a fusion experiment, two calcium free media, Ca free SOR2 medium and Boquest fusion medium, resulted in lower precocious activation (cleavage) rates after administration of the electrical pulse than the calcium containing Sor 2  medium (8.9% vs. 6.7% vs. 29.1%).   8.         Spontaneous activation (cleavage) of the porcine oocytes without an electric field was only 1.0%.      9.         Fusion of fibroblast-oocyte complexes in Ca free Sor 2 medium resulted in significantly higher fusion rates than in Boquest fusion medium (84.2% vs. 67.1%).   10.      Fusion of fibroblast-oocyte complexes matured for 42-43 hours gave significantly higher fusion rates than fusion of fibroblast-oocyte complexes matured for 38-40 hours (83.8% vs. 75.5%).   11.      In nuclear transfer experiments, maturation of oocytes for 40 hours resulted in a highly significant improvement in development to the blastocyst stage as compared to oocyte maturation for either 38 hours or 42 hours (9.6% vs. 14.8% vs. 4.9%). This was not seen in the parthenogenetic control groups in which there was no exposure-time effect observed in the blastocyst rate.   12.      After transfer of cloned embryos produced from in vitro matured oocytes, two of four recipient gilts established a pregnancy. One gilt farrowed and gave birth to four piglets of which two remain in good health at the time of writing.   13.      The recipient gilt was excluded from being the biological mother by analysis of 12 highly polymorphic microsatellite loci selected from the set developed at the University of Bonn. This microsatellite analysis confirmed that, among the four piglets born, two were derived from one fibroblast line and two were derived from a  second fibroblast line.     In conclusion, the results of this work indicate that it is possible to maintain the  developmental potential of porcine oocytes stored in TL-Hepes media with an osmolarity of 296 or 321  mOsmol for up to 7.5 hours. This allows sufficient time to perform subsequent steps in the nuclear transfer protocol. It is clear that additional activation with DMAP can improve activation rates of reconstructed complexes. Additional results demonstrate that micromanipulation steps within the nuclear transfer protocol have to be performed within a relatively short time window. The development rates of nuclear transfer derived embryos maintained in culture and the birth of live piglets after transfer to foster mothers demonstrate the functionality of the nuclear transfer protocol described here. Further changes in the composition of media and the conditions during embryo culture to gain a better quality of recipient oocytes will certainly improve the efficiency of this protocol. 

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zum Klonen von Schweinen durch somatischen Kerntransfer, um nach Transfer auf synchronisierte Empfängertiere vitale Klonferkel zu erhalten. Als Ausgangsmaterial wurden dazu in vitro gereifte porzine Eizellen aus Schlachthofovarien genutzt. Zur Auswertung der Versuche wurden die Kernzahlen, die Entwicklungsraten zu bestimmten Entwicklungsstadien, sowie in einigen Versuchen die Fusionsrate, bestimmt.   Hierzu wurden in einer ersten Versuchsphase anhand eines „parthenogenetischen  Modells“ Faktoren bestimmt, die eine effiziente in vitro Entwicklung ermöglichen. Die Ergebnisse dieser Versuche führten zur Entwicklung eines Protokolls, das die Entwicklungsfähigkeit porziner Oozyten während einer 7,5 stündigen Lagerung außerhalb des Brutschrankes aufrechterhält, was für die einzelnen Schritte des somatischen Kerntransfers nötig ist. Diese Experimente führten auch zur Optimierung der Aktivierung, was zu hohen parthenogenetischen Teilungs- und Blastozystenraten führte.   In der zweiten Versuchsphase wurde das Protokoll auf die Erzeugung porziner Kerntransfer-Embryonen übertragen, was in vitro zu einer zufriedenstellenden Blastozystenrate führte. Dies wurde erreicht durch eine Optimierung der Fusionseffizienz (Fusionsrate) und durch Austesten der optimalen Eizellreifungsdauer, was anhand der Entwicklungsrate zum Blastozystenstadium beurteilt wurde.   In der dritten Versuchsphase wurde das entwickelte Kerntransferprotokoll erfolgreich hinsichtlich einer In-vivo-Entwicklung in vitro erzeugter Kerntransfer-Embryonen überprüft. Hierzu wurden nach dem Protokoll dieser Arbeit erstellte Kerntransfer-Embryonen auf synchronisierte Empfängertiere übertragen.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:   1.                 Nach Anwendung des zweistufigen Standardreifungsprotokolls konnte 44 h nach Reifungsbeginn, durch Auffinden einer Metaphasenplatte nach Hoechstfärbung, eine Reifungsrate von 71% ermittelt werden.   2.                 Durch Einsatz eines elektrischen Feldes von 1,0 KV/cm DC für 45 µs konnten bei 72,9% aller Oozyten die Teilung und bei 29,6% der Oozyten die parthenogenetische Entwicklung bis zum Blastozystenstadium induziert werden. Damit war eine elektrische Feldstärke von 1,0 KV den elektrischen Feldern einer Stärke von 1,25 KV/cm, 1,5 KV/cm und 1,75 KV/cm bezüglich der Teilungsrate (72,9% vs. 60,5% vs. 25,9% vs. 13,8%) und der Blastozystenrate (29,6% vs. 12,9% vs. 4,3% vs. 0%), signifikant überlegen. Keine signifikanten Unterschieden konnten diesbezüglich zu einer elektrischen Feldstärke von 0,8 KV/cm ermittelt werden.   3.                 Eine einphasige In-vitro-Kultur der aktivierten parthenogenetischen porzinen Embryonen in NCSU23 Medium war einer dreiphasigen Kultur (CR2, NCSU23, NCSU23+ FCS) bezüglich der Teilungsrate signifikant überlegen (62,9% vs. 54,7%).   4.                 Eine 7,5 stündige Aufbewahrung der Oozyten vor der parthenogenetischen Aktivierung in Tl-Hepes Ca-free ergab eine signifikant höhere durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten als Aufbewahrung in Hb-NCSU23 (22,3% vs. 18,7%).   5.                 Während einer 7,5 stündigen Aufbewahrung der Oozyten vor der parthenogenetischen Aktivierung führte eine Osmolarität im Arbeitsmedium von 296 oder 321 mOsmol zu signifikant höheren Blastozystenraten (18,3% vs. 24,4-26,2%) als eine Osmolarität von 271 mOsmol.   6.                 Eine zusätzliche Aktivierung durch Inkubation mit 6-DMAP war einer alleinigen Aktivierung im elektrischem Feld, bezüglich der Entwicklung zum Blastozystenstadium, signifikant überlegen (40,4% vs. 26,5%).   7.                 Durch Fusion in den Ca2+-freien SOR2 Ca-free- und Boquest-Fusionsmedien konnte die vorzeitige Aktivierung der Oozyten (Teilungsrate) gegenüber dem SOR2 Medium signifikant reduziert werden (8,9% vs. 6,7% vs. 29,1%).   8.                 Die spontane Aktivierung (Teilungsrate) der porzinen Oozyten fiel im Protokoll der vorliegenden Arbeit mit 1% sehr gering aus.   9.                 Die Fusion von Fibroblasten-Oozytenkomplexen in SOR2 Ca-free- Fusionsmedium erbrachte signifikant bessere Fusionsraten als die Fusion im Boquest-Fusionsmedium (84,2% vs. 67,1%).   10.             Die Fusion von Fibroblasten-Oozytenkomplexen, die aus 42-43 h gereiften Oozyten rekonstruiert worden waren, führte zu signifikant höheren Fusionsraten als die Fusion von Komplexen, die aus 38-40 Stunden gereiften Oozyten hergestellt waren (83,8% vs. 75,5%).   11.             Der Einsatz von 40 h gereiften Oozyten im Kerntransfer führte zu einer hochsignifikant höheren In vitro Entwicklung zum Blastozystenstadium als der Einsatz von 38 h und 42 h gereiften Oozyten (9,6% vs. 14,8% vs. 4,9%). Im Gegensatz dazu führte die Variation der Reifungsdauer von 38-42 h bei der parthenogenetischen Kontrollgruppe zu keinen signifikanten Unterschieden bezüglich Teilungsrate und Entwicklung zum Blastozystenstadium.   12.             Nach Übertragung von durchschnittlich jeweils 150 Kerntransfer-Embryonen auf 4 Empfängersauen, konnten 2 Trächtigkeiten etabliert werden; eine Sau kam zur Geburt und warf 4 Ferkel. Hiervon waren 2 Ferkel vital und entwickelten sich bis heute normal. 13.             Durch Mirkosatellitenanalysen an 12 verschiedenen DNA Loci (zusammengestellt von der Landwirtschaftlichen Fakultät Bonn) konnte das Trägertier sicher als biologische Mutter ausgeschlossen werden. Je zwei der Ferkel waren genetische Klone zueinander.      Die Ergebnisse zeigen, dass durch Lagerung der Oozyten in Tl-Hepes Medium mit einer Osmolarität von 296 oder 321 mOsmol die Entwicklungsfähigkeit porziner Oozyten während des Zeitraumes, der zur Herstellung von Kerntransfer-Komplexen benötigt wird, aufrechterhalten werden kann. Es wurde deutlich, dass eine zusätzliche Aktivierung im Anschluss an eine elektrische Stimulation, durch Inkubation in Gegenwart des Protein-Kinase-Inhibitors 6-DMAP, die Aktivierung von rekonstruierten Kerntransferkomplexen verbessern kann. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die einzelnen Arbeitsschritte des Kerntransfers innerhalb eines sehr engen Zeitfensters erfolgen müssen. Die aufgezeigte In-vitro-Entwicklung, sowie die Geburt vitaler Ferkeln nach Transfer in vitro produzierter KT-Embryonen auf Empfängertiere, beweisen die Funktionalität des entwickelten Kerntransfer- Protokolls. Weitere Forschungsarbeiten, insbesondere Verbesserungen bezüglich der Auswahl der Empfängeroozyten und der Kulturmedien, können zu einer weiteren Effizienzsteigerung des Systems beitragen.

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Hölker, Michael: Experimentelle Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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