Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung einer oral applizierbaren DNA-Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest

Linne, Christiane

In this project the applicability of attenuated S. typhimurium as a carrier for a newly developed E2-based DNA-vaccine was tested. The selected bacteria have already been successfully used in murines. The E2-gene of CSFV was cloned into the eukaryotic expression-plasmid pCMV (high-copy), pCMV (low-copy) and pSecTag2A (low-copy). Another clone, available at the Institute of Virology, was also included in the study. Through direct and indirect immunoperoxidase staining as well as Western-blotting the transient expression of the desired proteins was verified. To obtain evidence that DNA-transfer from the bacterial delivery-vehicle to swine cells can take place in vitro, primary porcine macrophages were infected with Salmonellae harbouring different E2-expression plasmids. Transient expression of the E2-protein could be demonstrated for all vectors used. In the first animal study it was possible to proof the invasion of the gutt’s superficial epithilium by FITC-labelled S. typhimurium after direct administration into intestinal loops. The same approach, this time administrating plasmid-transformed Salmonellae led to the desired expression of the green fluorescent protein (gfp) and E2. Upon establishing the general feasibility of using Salmonella as a carrier for expression vectors in porcines, the aspects of oral delivery had to be examined. Three days after administrating pCMVß- transformed Salmonellae orally, the vector could be derived from intestinal tissue samples using PCR-technique, protein expression could not be demonstrated, though. Oral administration of Salmonella transformed with pCMVE2 and pSecTag2AE2 did not result in the induction of neutralising antibodies against CSFV. The application of a commercially available E2-vaccine seemd to lead ‑in comparison to the control group- to a moderately faster immune response and higher titers of neutralizing antibodies in the animals immunized with pSecTag2AE2 in comparison to the control group. In the last experiment, different plasmids and Salmonellae (SALMOPORC, S. typhimurium, high- and low-copy plasmids) were used to immunize pigs against a CSFV callenge-infection in order to determine whether the virus-challenge generates a protective immune response. The purpose of using low-copy plasmids was to ensure their stability in salmonella, as well as improve the bacteria’s abiltiy to invade different tissues. During the course of the CSFV-infection in its natural host, the clinical symptoms and changes in the B- and T-cell immune responses were monitored. Virus isolation from leucocytes was also performed. In three out of four experimental groups as well as in the controll group the animals  developed the acute clinical course of classical swine fever, in the fourth group (immunized with pSecTag2AE2 in SALMOPORC) two out of three animals displayed a partial protection against CSF.As was shown, Salmonella has the potential to be used as a carrier for DNA-vaccine in large animals, but the system needs to be further improved in order to generate a suffient immune response.

Untersucht wurde die Eignung von attenuierten Salmonellen (S. typhimurium aroA SL 7207) als oral applizierbare Carrier für eine, ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zu erstellende E2-basierte DNA-Vakzine. Der eingesetzte Salmonellenstamm ist im murinen System bereits erfolgreich eingesetzt worden. Das E2‑Gen des KSP-Virus wurde in die eukaryontischen Expressionsplasmide pCMV (high‑copy), pCMV (low‑copy) und pSecTag2A (low‑copy) kloniert. Darüber hinaus wurde das im Institut für Virologie vorhandene Konstrukt pSecTag2AE2 in die Untersuchungen einbezogen. Mittels direkter und indirekter Immunperoxidase-Färbung, sowie Western‑blotting konnte die transiente Expression der authentischen Proteine in Zellkultur nachgewiesen werden. Auf primären porcinen Makrophagen wurde die Eignung von S. typhimurium als Carrier in vitro untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Plasmide der transformierten Salmonellen in die Makrophagen gelangen und es dort nachfolgend zur transienten E2-Expression kommt. In vivo konnte im ersten Tierversuch, nach direkter Injektion von FITC‑markierten S. typhimurium in den Darm, die Invasion der Bakterien in das superfizielle intestinale Epithel nachgewiesen werden. Die Injektion von Plasmid-transformierten Salmonellen in intestinale Loops führte zur Expression von GFP und E2 im Darmgewebe. Nach der Etablierung des Carrier-Systems im porcinen Organismus wurde untersucht, ob es auch nach oraler Applikation transformierter Salmonellen zu einem Transport des pCMVß-Plasmids in den Wirtstierorganismus kommt. Es gelang, drei Tage nach der Verabreichung des Plasmids mittels PCR dieses im Darmgewebe nachzuweisen. Ob die nachgewiesenen Gene von der Zelle auch tatsächlich werden, konnte nicht beurteilt werden. Die orale Applikation der plasmid‑transformierten Salmonellen (pCMVE2, pSecTag2AE2) führte nicht zur Induktion neutralisierender Antikörper gegen das KSPV. Jedoch deutete sich nach der Immunisierung, der mit den Salmonellenkonstrukten vorbehandelten Schweine, mit einer kommerziell erhältlichen Vakzine  eine schnellere  Immunreaktion verbunden mit höheren Titern an neutralisierenden Antikörpern der mit pSecTag2AE2-immunisierten Gruppe an. In einem weiteren Tierversuch wurden verschiedene Salmonellen-Plasmid-Kombinationen (SALMOPORC, S. typhimurium, high- und low-copy Plasmide) in einem Virus-Challenge zur Immunisierung eingesetzt. Der Einsatz der ‚low copy’‑Plasmide sollte dabei zum einen eine größere Stabilität der Konstrukte in den Salmonellen und zum anderen eine bessere Invasivität der attenuierten Bakterien gewährleisten. Unter der Belastungsinfektion mit dem KSPV sollte untersucht werden, ob es zur Ausbildung einer protektiven Immunantwort kommt. Dazu wurden das klinische Bild und die zelluläre und humorale Immunantwort verfolgt, sowie eine Virusisolierung aus Leukozyten durchgeführt. In drei der vier Versuchsgruppen, sowie in der Kontrollgruppe entwickelte sich das akute, klinische Bild der Klassischen Schweinepest, in einer weiteren Versuchsgruppe (immunisiert mit pSecTag2AE2 in SALMOPORC) lag bei zwei der drei Tiere ein partieller Schutz gegenüber der Infektion mit dem KSPV vor. Die eingesetzten Salmonellen haben das Potential auch im Großtier als Carrier für DNA-Vakzinen eingesetzt zu werden, das System muss allerdings weiter verbessert werden, um eine zufriedenstellende Immunantwort zu erzielen.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Linne, Christiane: Entwicklung einer oral applizierbaren DNA-Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export