Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie

Schmidbauer, Stefan

In order to gain a better understanding upon the pathogenesis of interstitial lung diseases transcutaneous lung biopsies of six adult horses were examined. In order to induce interstitial pneumonia these horses received once 6 mg perilla ketone (1-(3- furyl) 4 –methylpentatone) per kg body weight intravenously. The results of the lung biopsies were examined over a period of four weeks post application (post appl.). The morphological changes were investigated by light- and transmission electron microscopy. As parameters for the disease follow-up, the cellular proliferation rate, cell death rate, rate of granulo- histiocyte infiltration and the percentage of collagenous and reticular fibers were evaluated by computer aided morphometric analysis. Because these factors are commonly accepted to play an important role in acute and chronic lung diseases, the expression rates of transforming growth factor-ß (TGF-ß), interleukin –1ß (IL-1ß), procollagen a1(1) (COL1A1) and procollagen a1(III) (COL3A1) were analyzed.. The reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) were used as a highly sensitive and specific method for studying these gene expressions. The following results were obtained: 1. Following intravenous application of 6 mg perilla ketone per kg body weight six horses developed changes typical for the exsudative (day 1 – 4), proliferative (day 4 – 11) and healing phase (day 11 – 18) of interstitial pneumonia. In the exsudative phase and in the proliferative phase an epithelial and endothelial damage of the alveolar septa in varying degree and low grade exsudation were observed. The cellular proliferation rate, as a marker for regenerative and reparative processes, significantly increased beginning on the first day of examination and reached a maximum value on day eight post appl.. After regression, eleven days after the end of the healing phase, an increased cellular proliferation was still detectable. The granulo-histiocyte infiltration also increased from day one post appl. and reached a maximum value at day eight. Afterwards a   decrease to the control level till day 15 occurred. Light microscopically, a low grade lymphocyte infiltration was seen in the fibriproliferative phase. In two moribund horses, that had to be euthanized because of the perilla ketone induced changes a significant increase of the cell death rate was detected. 2. In all animals with induced interstitial pneumonia an upregulation of COL1A1 and COL3A1 was observed after the first 24 hours of the exsudative phase, lasting till day eleven post appl. after the end of the light microscopic evaluated healing phase, not leading to morphological changes of any lung fibrosis. It can be concluded that in perilla keton induced interstitial pneumonia an overexpression of procollagen a1(1) and procollagen a1(III) in between the observation period of 29 days must not lead to lung fibrosis. This must be due to antiregulatory mechanisms in the multiregulated metabolic pathway of collagene. It remains unclear, if the gene expression rates of COL1A1 and COL3A1 will serve as valuable markers for the prognostic factors of lung fibrosis after interstitial pneumonia. The conditions under which an upregulated expression leads to a lung fibrosis in the horse were not evaluated. More basic clinical studies are necessary to deal with this specific problem. 3. TGF-ß and IL-1ß upregulation was observed in two horses each, respectively. These increased expressions did not lead to detectable lung fibrosis. This work constitutes the first extensive and coherent study dealing with all stages of interstitial pneumonia in the horse until the healing phase. The combination of transcutaneous biopsy, extensive morphologic and morphometric analysis in combination with the reverse transcriptase polymerase chain reaction in minimal biopsies constitutes a methodic innovation with possible model character for future molecular pathological studies in living animals.

Um einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Pathogenese interstitieller Lungenerkrankungen zu leisten, wurden im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von vier Wo-chen transkutan entnommene Lungenbiopsieproben von sechs ausgewachsenen Pferden un-tersucht. Bei den Tieren sollte durch die einmalige intravenöse Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl) 4- Methylpentaton) über einen akuten, diffusen Alveolarschaden eine interstitielle Pneumonie induziert werden. Die morphologischen Veränderungen wurden auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene untersucht. Als wesentliche Parameter zur Charakterisie-rung des Krankheitsverlaufs wurden die Zellproliferations- und die Zelluntergangsrate, die Rate granulohistiozytärer Infiltrate und der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen durch computergestützte, morphometrische Analyse ermittelt. Aufgrund ihrer gr oßen Bedeutung bei akuten und chronischen Lungenerkrankungen und ihre mögliche Eignung als prognostische Faktoren quoad vitam und quoad valitudinem, erfolgte darüber hinaus die Bestimmung der Expressionsraten des Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), von Interleukin- 1ß (IL-1ß), Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1). Mit der Reverse Transkriptase-quantitativen Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) stand hierfür eine hochsensitive und -spezifische Untersuchungsmethode zur Verfügung, die für Genexpressionsstudien anhand von Minimalbiopsieproben geeignet war. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1. Durch die einmalige intravenöse Applikation von 6 mg Perillaketon / kg KG konnten bei sechs Pferden Veränderungen induziert werden, wie sie für die exsudative (Tag 1 – 4), die proliferative (Tag 4 – 11) und die Ausheilungsphase (Tag 11 – 18) der interstitiellen Pneumonie beschrieben sind. Von der exsudativen Phase bis in die proliferative Phase konnten in unterschiedlichem Umfang epi- und endotheliale Defekte der alveolä ren Septen mit geringgradiger Exsudation in die Alveolarlumina beobachtet werden. Die Zellproliferationsrate als Ausdruck regenerativer und reparativer Prozesse stieg ab dem 1. Versuchstag deutlich an und erreichte an Tag 8 ihren Maximalwert. Nach einem Rückgang war auch 11 Tage nach Ende der Ausheilungsphase noch eine verstärkte   Zellproliferation feststellbar. Die Rate granulohistiozytärer Infiltrate stieg ebenfalls von Tag 1 bis zu ihrem Maximum an Tag 8 an. Im Anschluss erfolgte eine Regression auf das Ausgangsniveau bis Tag 15. Lediglich in der proliferativen Phase lag lichtmikroskopisch feststellbar eine geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate vor. Bei zwei Tieren, die aufgrund der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen in moribundem Zustand euthanasiert werden mussten, zeigte sich unmitte lbar ante mortem ein deutlicher Anstieg der Zelluntergangsrate. 2. Bei allen Tieren, die Veränderungen wie bei interstitieller Pneumonie aufwiesen, konnte bereits nach 24 h in der exsudativen Phase eine Hochregulierung der Expression von COL1A1 und COL3A1 beobachtet werden, die bis zum Abschluss des Beobachtungszeitraums am 11. Tag nach Ende der lichtmikroskopisch festgestellten Ausheilungsphase noch anhielt. Eine signifikante Zunahme extrazellulärer Matrixbestandteile an den alveolären Septen oder morphologische Korrelate von Lungenfibrose konnten im Beobachtungszeitraum von 29 Tagen nicht nachgewiesen werden. Grundsätzlich ist aus diesen Ergebnissen zu schließen, dass eine deutliche Hochregulierung von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) bei Perillaketoninduzierter interstitie ller Pneumonie nicht zu Entstehung von Lungenfibrose führen muss. Als Ursache sind hier ungeklärte gegenregulatorische Mechanismen im multiregulierten Stoffwechselweg anzunehmen. Die Eignung der Genexpressionsraten von COL1A1 und COL3A1 als prognostische Faktoren für Lungenfibrose nach interstitieller Pneumonie ist aufgrund der gewonnenen Ergebnisse fraglich. Unter welchen Bedingungen und ab welchem Ausmaß eine verstärke Expression beim Pferd zur Lungenfibrose führt, konnte in der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden. Hierfür sind nach diesen grundsätzlichen, sondierenden Versuchen umfangreichere, klinische Studien erforderlich. 3. Bei je zwei Pferden mit pathomorphologischen Veränderungen wie bei interstitieller Pneumonie konnte eine Hochregulierung der TGF-ß-Expression und der IL-1ß-Expression beobachtet werden. Diese verstärkte Expression führte bei den betroffenen Tieren jedoch nicht zu messbarer Fibrose. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals umfangreiche und zusammenhängende Untersuchungen in allen Stadien der interstitiellen Pneumonie beim Pferd bis zur Ausheilung durchgeführt. Die Kombination der transkutanen Entnahmetechnik intra vitam, umfangreicher morphologischer und morphometrischer Untersuchungen sowie der RT-qPCR an Minimalbiopsieproben der Lunge des Pferdes stellt eine methodische Innovation dar, die Modellcharakter für zukünftige molekularpathologische Studien am lebenden Tier haben kann.

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Schmidbauer, Stefan: Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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