Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression des E2-Glycoproteins des Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) mit Hilfe von Plasmid- und Virusvektoren

Köhl, Wiebke

In most cases infections of immunocompetent cattle with bovine viral diarrhea virus (BVDV), a Pestivirus of the family Flaviviridae, cause only mild clinical symptoms or are asymptomatic. However, transplacental transmission of BVDV is able to induce abortion, stillbirth, malformations and persistently infected calves, which die after 6 to 24 months of mucosal disease. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV), a Pneumovirus of the family Paramyxoviridae, is the major cause of lower respiratory tract disease in young calves at the age between 4 weeks and 6 months. E2 protein is the target of the protective immune response elicited by a BVDV infection. E2 is retained in the endoplasmic reticulum (ER) of infected cells. We have constructed different chimeric, truncated and mutated forms of the E2 protein to examine the expression, transport and localization of E2. In chimeric E2 proteins the membrane anchor and/or cytoplasmic tail of E2 was exchanged against the corresponding regions of BRSV-F-protein or vesicular stomatitis virus (VSV) G protein. The truncated forms of the E2 protein had deletions in their cytoplasmic tail and/or membrane anchor. Additionally, E2 proteins were constructed with a point mutation in the middle of the membrane anchor, replacing an arginine residue by an alanine. For expression of the different E2 proteins three vectors were used: pTM1 as plasmid vector, VSV and BRSV as viral vectors. VSV is a member of the genus Vesiculovirus of the family Rhabdoviridae. The different E2 genes were cloned and expressed with pTM1 by transfection of BSR-T7/5 cells. The results of these expression studies indicate, that there is a retention signal in the membrane anchor of E2. The central arginine in the membrane anchor is an important element of the retention signal in the E2 protein, because mutation resulted in surface expression of E2 protein. To express E2-G(MT) (E2 containing the membrane anchor and cytoplasmic tail of VSV G) using VSV as vector, the E2-G(MT) gene was cloned between the G and L gene into VSV antigenome. After successful virus rescue, BHK-21-cells were infected with VSV-E2-G(MT) and the expression of E2-G(MT) was examined. E2-G(MT) was expressed at the cell surface and was incorporated into VSV-E2-G(MT)-virions. The proteins E2, E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A (E2-G(MT) containing a point mutation in the cytoplasmic tail) and E2(MTdel) (E2 with the membrane anchor and cytoplasmic tail deleted) were chosen for expression using BRSV as vector. These proteins are expected to have a different distribution in infected cells. The different localization of the E2 proteins may influence the immune response, when the recombinant viruses will be used to immunize calves. The E2 genes were inserted into the BRSV antigenome as additional gene upstream of the NS1 gene. To facilitate the insertion of the E2 genes into the BRSV antigenome, a cloning cassette with restriction sites and regulatory sequences was cloned and integrated into the antigenome upstream of the NS1 gene. After successful virus rescue, different cell lines were infected with the recombinant viruses and the expression of the E2-proteins was examined. Strong expression of all E2 proteins was observed with different cellular distribution: E2 was localized in the ER. E2-G(MT) and E2-G(MT)Y/A were expressed at the cell surface. Interestingly E2, E2-G(MT) and E2-G(MT)Y/A were also secreted into the supernatant. E2(MTdel) was only detected in the ER. After virus sedimentation through a sucrose cushion all E2 proteins were detected together with BRSV, but at present it is not clear, whether the E2 proteins were integrated into BRSV virions or whether they were only associated with the virions. The viral vectors VSV and BRSV are valuable tools for the expression of E2 proteins with high expression rates. With recombinant BRSV expressing the E2 proteins it is possible to immunize with one virus against two diseases. Therefore, these viruses are interesting candidates for a new vaccine.

Das Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) ist dem Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae zugeordnet. Infektionen von immunkompetenten Rindern mit dem BVD-Virus verlaufen meist nur mit milden klinischen Symptomen oder sind symptomlos. Jedoch können transplazentare Übertragungen von BVDV zu Aborten, Fruchtbarkeitsstörungen, Missbildungen oder zur Geburt persistent infizierter Kälber führen, die nach 6 bis 24 Monaten an der Mucosal Disease sterben. Das bovine respiratorische Synzytialvirus (BRSV) gehört innerhalb der Familie Paramyxoviridae zu dem Genus Pneumovirus und ist der wichtigste virale Infektionserreger akuter Atemwegserkrankungen bei Kälbern im Alter von 4 Wochen bis 6 Monaten. Hauptziel einer protektiven Immunantwort bei einer BVDV-Infektion ist das E2-Protein. Dieses Protein wird in infizierten Zellen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten. Wir haben verschiedene chimäre, trunkierte und mutierte Formen des E2-Proteins erstellt und die Expression, den Transport und die Lokalisation dieser Proteine untersucht. Bei den chimären E2-Proteinen wurde der Membrananker und/oder der cytoplasmatische Abschnitt gegen die entprechenden Regionen des BRSV-F- oder des G-Proteins des Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) ausgetauscht. Die trunkierten E2-Proteine wiesen Deletionen in ihrem Membrananker und/oder cytoplasmatischen Abschnitt auf. Zusätzlich wurden E2-Proteine mit einer Punktmutation in der Mitte des Membranankers erstellt, bei denen Arginin gegen Alanin ausgetauscht wurde. Für die Expression wurden drei Vektoren verwendet: pTM1 als Plasmidvektor, VSV und BRSV als virale Vektoren. VSV wird dem Genus Vesiculovirus innerhalb der Familie Rhabdoviridae zugeordnet. Die verschiedenen E2-Gene wurden kloniert und mit Hilfe von pTM1 durch Transfektion in BSR-T7/5-Zellen exprimiert. Das Ergebnis der Expressionsstudien spricht für ein Retentionssignal innerhalb des E2-Membranankers. Das zentrale Arginin im Membrananker stellt einen wichtigen Bestandteil des Retentionssignals dar, denn diese Mutation führt zur Oberflächenexpression des E2-Proteins. Um E2-G(MT) (E2, welches den Membrananker und cytoplasmatischen Abschnitt von VSV-G enthält) mit Hilfe von VSV zu exprimieren, wurde das E2-G(MT)-Gen zwischen dem G- und L-Gen in das VSV-Antigenom einkloniert. Nach erfolgreichem Virus-Rescue wurden BHK-21-Zellen mit VSV-E2-G(MT) infiziert und die E2-G(MT)-Expression untersucht. E2-G(MT) wurde an der Zelloberfläche exprimiert und in VSV-E2-G(MT)-Virionen inkorporiert. Die Proteine E2, E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A (E2-G(MT), welches eine Punktmutation im cytoplamatischen Abschnitt enthält) und E2(MTdel) (E2 mit deletiertem Membrananker und cytoplasmatischem Abschnitt) wurden für die Expression mit dem viralen Vektor BRSV ausgewählt. Für diese Proteine wurde eine unterschiedliche Verteilung in infizierten Zellen erwartet. Die unterschiedliche Lokalisation der E2-Proteine kann bei einer späteren Immunisierung von Kälbern die Immunantwort gegen die rekombinanten BRS-Viren beeinflussen. Die E2-Gene wurden als zusätzliches Gen vor das NS1-Gen in das BRSV-Antigenom eingefügt. Um die Integration der E2-Gene in das BRSV-Antigenom zu erleichtern, wurde eine Klonierungskassette mit Restriktionsschnittstellen und regulatorischen Sequenzen erstellt und und vor dem NS1-Gen in das Antigenom integriert. Nach erfolgreichem Virus-Rescue wurden verschiedene Zelllinien mit den rekombinanten Viren infiziert und die E2-Expression untersucht. Alle E2-Proteine wurden stark in infizierten Zellen exprimiert, wobei eine unterschiedliche zelluläre Verteilung zu beobachten war: E2 war im ER lokalisiert, während E2-G(MT) und E2-G(MT)Y/A an der Zelloberfläche exprimiert wurden. Interessanterweise wurden E2, E2-G(MT) und E2-G(MT)Y/A zusätzlich in den Überstand sezerniert. E2(MTdel) war ausschließlich im ER nachweisbar. Nach einer Virussedimentation durch ein Saccharosekissen konnten alle E2-Proteine zusammen mit den Virionen nachgewiesen werden, jedoch ist es derzeit nicht klar, ob die E2-Proteine in die BRS-Virionen integriert wurden oder ob sie mit diesen nur locker assoziiert waren. Die viralen Vektoren VSV und BRSV sind gut geeignet zur Expression der E2-Proteine, wobei es zu einer hohen Expressionsrate der Fremdproteine kommt. Mit E2-exprimierendem BRSV ist es möglich, mit einem Virus gegen zwei Erkrankungen zu immunisieren. Aufgrund dieser Eigenschaft wird es zu einem interessanten Kandidaten für einen neuen Impfstoff.

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Köhl, Wiebke: Expression des E2-Glycoproteins des Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) mit Hilfe von Plasmid- und Virusvektoren. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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