Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Genome scan for quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian Warmblood horses using an optimised microsatellite marker set

Löhring, Kathrin

The aim of this work was to establish a genome-wide microsatellite marker set for the horse in order to make possible whole genome scans for the identification of the chromosomal locations of quantitative trait loci (QTL) that significantly influence the development of equine osteochondrosis (OC). In a first step, a whole-genome scan panel was established consisting of 157 equine microsatellite markers. In order to test the suitability of the marker set for genome-wide QTL studies, 86 Hanoverian Warmblood horses were chosen for genotyping. Multiplex sets were established in order to increase efficiency of genotyping. The markers were equally spaced over all 31 autosomes and the X chromosome, and covered a total distance of 2081 cM, corresponding to 76.5% of the equine genome. The average distance between the markers used was 19.1 cM within the linkage groups. Due to the small number of markers and the missing assignment of the markers to linkage groups, the density of markers was low on ECA07 and ECA28. The average observed heterozygosity of the whole marker set was 65.7%, the average expected heterozygosity was 64.6%, and the average polymorphism information content (PIC), 60.3%. The average PIC of the chromosomes ranged from 46.7% to 73.7%. The majority of the 157 markers (n = 123, 78.34%) was highly informative, with a PIC > 50 %. Therefore, this new microsatellite marker set was classified as being well suited for whole-genome scans. In a second step, the marker set described above was used to genotype 123 foals affected either with OC or OCD or both, their respective dams, and 13 sires. The marker genotypes, the pedigree data and the phenotype data of the foals were analysed using non-parametric linkage analysis based on IBD mapping. Separate analyses were performed for OC (fetlock and/or hock), OCD (fetlock and/or hock), fetlock OC, fetlock OCD, hock OC, and hock OCD. The linkage analyses were performed for both sexes together and for each sex separately. In total, 27 chromosome-wide QTL for the different traits were found on 13 different equine chromosomes. Six of these QTL were present in both sexes, nine in male animals, and twelve in female animals. One chromosome-wide QTL was also found to be of genome-wide significance. The distribution of the QTL was heterogeneous with respect to sex and joint type. The QTL for fetlock OC/OCD and hock OC/OCD were located on different chromosomes, indicating that these traits may be inherited independently. The whole-genome scan carried out in this study was a first step towards the identification of candidate genome regions harbouring genes responsible for equine OC. Further investigations are necessary to verify the results obtained here and to refine the map positions of the QTL already identified for OC and OCD.

Die vorliegende Arbeit war Teil eines interdisziplinären Projekts in Zusammenarbeit mit mehreren Instituten und dem Verband hannoverscher Warmblutzüchter e.V., das im Frühjahr 2001 begann und dieses Jahr im Dezember abgeschlossen werden soll. Das Gesamtprojekt bestand aus insgesamt 10 Teilprojekten, die an unterschiedlichen Fakultäten durchgeführt wurden. Ziel dieses Projektes war es, den Einfluss unterschiedlicher Faktoren auf die Entstehung von Osteochondrose beim Hannoverschen Warmblut zu untersuchen. Die Anfertigung der Röntgenaufnahmen der Fohlen und deren Stuten erfolgte durch N. Krekeler und M. Reininghaus. P. Arnan fertigte die Röntgenaufnahmen der Zweijährigen an. Der röntgenologische Status einiger Hengste, die in dieser Studie als Väter der Fohlen vertreten waren, wurde von V. Welker erhoben. Diese Arbeiten sowie die Auswertung der Röntgenbilder wurden unter Anleitung von Prof. Dr. B. Hertsch in der Pferdeklinik der Freien Universität Berlin durchgeführt. Die Einflüsse von Mineralstoff- und Spurenelementversorgung sowie von metabolischen und endokrinologischen Faktoren wurden von A. Borchers, M. Granel und S. Winkelsett untersucht. Diese Arbeiten fanden am Institut für Tierernährung an der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt und wurden von Prof. Dr. M. Coenen geleitet. Untersuchungen bezüglich der Haltung und Bewegung der Pferde sowie populationsgenetische Untersuchungen wurden von M. Schober und A. Wilke an der Georg-August-Universität Göttingen durchgeführt. Die Leitung dieser Arbeitsgruppe hatte Prof. Dr. E. Bruns. Ziel der vorliegenden Arbeit am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover war es, den molekulargenetischen Einfluss auf die Entstehung der Osteochondrose zu untersuchen. Einleitung Bei der Osteochondrose (OC) handelt es sich um eine Jungtiererkrankung, die bei Tieren unterschiedlicher Spezies auftritt und beim Pferd eine der wichtigsten degenerativen Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellt. OC ist durch eine Störung der enchondralen Ossifikation im Wachstumsknorpel der Gelenkoberfläche und der Epiphysenfugen charakterisiert. Eine derartige Ossifikationsstörung kann in verschieden Gelenken auftreten (Fessel-, Sprung-, Knie-, Schulter-, Hüft- und Wirbelgelenke), am häufigsten sind jedoch Fessel-, Sprung- und Kniegelenke betroffen. Die Ossifikationsstörung ist durch das Ausbleiben der Mineralisation und der Gefäßeinsprossung charakterisiert. Aufgrund dieser Störung kommt es zu einer Retention von hypertrophiertem Wachstumsknorpel, der schließlich in Gestalt eines Knorpelkerns die Primärläsion darstellt. Aus dieser Primärläsion, die auch als Chondrodysplasie bezeichnet wird, können bei weiterer Belastung Veränderungen im Sinne einer Osteochondrose hervorgehen. Typische Anzeichen einer Osteochondrose sind subchondrale Frakturen und zystoide Defekte. Sind freie Knorpel-/Knochenfragmente im Gelenk vorhanden, wird die Erkrankung als Osteochondrosis dissecans (OCD) bezeichnet. Schliffusuren und Synoviitiden können als Begleiterscheinung auftreten. Diese Veränderungen können sich weiter zu degenerativen Gelenkerkrankungen wie zum Beispiel Osteoarthrosis entwickeln. Sind Wirbelgelenke betroffen, kann es zum sogenannten Wobbler Syndrom kommen. Je nach Schwere der Erkrankung kommt es bei den betroffenen Tieren zu Leistungseinbußen, schwerwiegende osteochondrotische Veränderungen im Zusammenhang mit klinischen Symptomen, wie Gelenkanschwellung, wiederkehrende Lahmheit und Schmerzen, können zum Verlust des Tieres führen. Zahlreiche Studien belegen, dass die Prävalenz von Osteochondrose in verschieden Pferdepopulationen (v.a. Traber und Warmblutpferde) bis zu 25 % betragen kann. Die Ursachen für die Entstehung der Osteochondrose sind zur Zeit noch nicht bekannt. Man geht von einem multifaktoriellen Geschehen aus, in dem schnelles Wachstum, übermäßige Ernährung, Mineralstoffimbalancen und hormonelle Einflüsse eine Rolle spielen. Heritabilitätsschätzungen in verschiedenen Studien haben gezeigt, dass auch eine genetische Komponente an der Entstehung der Erkrankung maßgeblich beteiligt ist. Zur Zeit sind jedoch keine potentiellen Gene für die Entstehung von OC/OCD bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein Markerset bestehend aus hochpolymorphen Mikrosatellitenmarkern zu entwickeln, um in einer anschließenden genomweiten Suche Quantitative Trait Loci (QTL) für die Entstehung von Osteochondrose bzw. Osteochondrosis dissecans zu identifizieren. Entwicklung des Mikrosatellitenmarkersets Auswahl der Marker für das Markerset Zunächst wurden aus der zur Zeit vollständigsten genetischen Karte von SWINBURNE et al. (2000) und der HORSEMAP database der INRA Biotechnology Laboratories Home Page (http://locus.jouy.inra.fr) 157 Mikrosatellitenmarker ausgewählt. Das primäre Auswahlkriterium war die Position der einzelnen Marker auf der genetischen Karte. Alle ausgewählten Mikrosatelliten waren gleichmäßig auf den 31 Autosomen und dem X-Chromosom verteilt. Der Abstand zwischen den Markern sollte eine Länge von 20 cM nicht überschreiten. Weiterhin war es wichtig, dass die Marker ausreichend informativ für die Kopplungsanalyse waren. Die Kriterien, auf die bei der Auswahl geachtet wurden, waren eine Anzahl von Allelen größer als 5 und ein Heterozygotiegrad bzw. „Polymorphism Information Content“ (PIC) über 50 %. Für einige dieser Marker waren diese Merkmale in der aktuellen Literatur nicht angegeben. Diese Marker wurden aufgrund ihrer erwünschten Position auf der genetischen Karte ausgewählt. DNA-Isolierung und Genotypisierung der Mikrosatellitenmarker Von einer Population bestehend aus 86 Pferden der Rasse Hannoversches Warmblut wurde DNA aus EDTA-Blutproben unter Verwendung des QIAamp® 96 DNA Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) isoliert. Die verwendeten Mikrosatellitenmarker wurden unter identischen PCR-Bedingungen (Denaturierung bei 94°C für 4 Minuten, 35 Zyklen mit jeweils 30s bei 94 °C, 60s Annealing-Temperatur, 30s bei 72°C und 10 Minuten bei 4°C) in Anwesenheit von hitzestabiler DNA-Polymerase und spezifischer Primer amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit Formamid-Ladepuffer verdünnt, anschließend wurden die einzelnen Allele mit Hilfe von 6 %-igen Polyacrylamidgelen durch Gelelektrophorese auf dem automatischen Sequenziergerät LI-COR 4200/S-2 (LI-COR, Lincoln, USA) aufgetrennt und der Genotyp der Marker manuell bestimmt. Ergebnisse und Diskussion Um den Informationsgehalt und somit die Eignung eines jeden Markers zu bestimmen, wurden drei Qualitätskriterien für jeden Mikrosatelliten bestimmt: Der beobachtete Heterozygotiegrad (HO), der erwartete Heterozygotiegrad (HE) und der PIC. Ebenfalls wurde die Anzahl der einzelnen Allele pro Marker bestimmt. Angegeben wurden auch die Abstände der ausgewählten Marker untereinander innerhalb der Kopplungsgruppen in bezug auf die genetische Karte von SWINBURNE et al. (2000). Das gesamte Markerset hatte einen durchschnittlichen PIC von 60,4 %, einen durchschnittlichen erwarteten Heterozygotiegrad von 64,6 % und einen durchschnittlichen beobachteten Heterozygotiegrad von 64,7 %. Die mittlere Anzahl der Allele pro Marker lag bei 6,1. Der durchschnittliche Abstand zwischen den einzelnen Markern betrug 19,1 cM. In dieser Arbeit wurden Marker mit einem PIC < 25 % als wenig informativ eingestuft, Marker mit einem PIC von 25 - 50 % hatten einen mittleren Informationsgehalt und Marker mit einem PIC > 50 % galten als hoch informativ. Anhand dieser Einteilung konnten 3 Marker (1,91 %) als wenig informativ charakterisiert werden, 31 Marker (19,75 %) hatten einen mittleren Informationsgehalt und der überwiegende Teil der Marker (n = 123; 78,34 %) war mit einem PIC > 50 % hoch informativ. Zusätzlich zu den einzelnen Markern wurden HO, HE und PIC chromosomenweit bestimmt. Der chromosomenweite HO variierte in einem Bereich zwischen 49,5 % und 76,3 %, der chromosomenweite HE lag zwischen 50,3 % und 77,1 % und der chromosomenweite PIC betrug 46,7 % bis 73,7 %. Aufgrund der ermittelten Werte sowohl für die einzelnen Marker als auch für die Chromosomen und für das gesamte Markerset, wurde das Set als gut geeignet für die Durchführung einer genomweiten Suche nach QTL beim Hannoverschen Warmblut eingestuft. Da das Hannoversche Warmblut aus verschiedenen Rassen entstanden ist (Englisches Vollblut, Arabisches Vollblut, Anglo-Araber und verschiedene Warmblutrassen) kann das Set auch in diesen Rassen angewendet werden. Eine Eignung für Kaltblutpferde war in einer Arbeit über genomweite Suche nach QTL für Osteochondrose beim Süddeutschen Kaltblut bestätigt worden. Das gesamte Markerset deckt einen Bereich von 2081 cM ab, was einem Anteil von 76,5 % des Pferdegenoms entspricht. Im Vergleich mit der zurzeit aktuellsten RH-Karte des Pferdes wurde eine weitest gehende Übereinstimmung bezüglich der Positionen und Anordnungen der Marker mit den hier verwendeten Markern festgestellt. Das bestehende Markerset kann durch zusätzliche Marker der RH-Karte des Pferdes ergänzt werden. Durch eine Erhöhung der Markerdichte und der Genomabdeckung erhöht sich gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit, QTL mit diesem Markerset identifizieren zu können. QTL-Analyse Familienmaterial und Genotypisierung Im Rahmen der Röntgenuntersuchung wurden insgesamt 629 Fohlen und deren Mütter auf OC bzw. OCD in den Fessel-, Sprung- und Kniegelenken untersucht. Die Untersuchung der Fessel- und Kniegelenke erfolgte durch lateromediale Aufnahmen, für die Sprunggelenke wurden plantolaterale-dorsomediale Aufnahmen gewählt. 403 Fohlen (64.1 %) zeigten weder Veränderungen im Sinne einer OC noch einer OCD. 118 Fohlen (18.8 %) waren OCD positiv, 108 Fohlen (17.2 %) OC positiv. Von den 629 geröntgten Fohlen wurden 123 Tiere für die Genotypisierung ausgewählt. Da hier ein Untersuchungsansatz mit betroffenen Halbgeschwistergruppen gewählt wurde, waren alle Tiere entweder an OC oder OCD oder an OC und OCD erkrankt. Die Fohlen ließen sich in insgesamt 32 Halbgeschwistergruppen einteilen, die durchschnittliche Anzahl der Fohlen pro Halbgeschwistergruppe betrug 3,8. 55,7 % der Fohlen waren weiblich, 46,3 % waren männlich. Das durchschnittliche Alter zum Zeitpunkt der Untersuchung betrug 6,7 Monate. Zusätzlich zu den Fohlen wurden die dazugehörigen Stuten und in 13 Familien auch die Hengste genotypisiert. Die DNA-Isolierung und die Genotypisierung der Tiere mit dem oben erwähnten Markerset erfolgte unter den selben Bedingungen und mit den selben Methoden wie bei der Entwicklung des Markersets. Auswertung Die Ergebnisse der Genotypisierung wurden zusammen mit den Pedigreedaten und den Röntgenergebnissen mit Hilfe der Software Merlin (multipoint engine for rapid likelihood inference, Version 0.9.10) analysiert. Die Auswertung der Daten mittels einer nicht parametrischen Kopplungsanalyse basierte auf dem „identical-by-descent (IBD) Verfahren. In dem sogenannten All-Modus (höhere Wichtung von 3 und mehr betroffenen Tieren) wurden die Ergebnisse der Genotypisierung aller Marker mit den Phänotypen getestet. Im Pairs-Modus (gleichmäßige Wichtung der betroffenen Tiere) wurden die Markerallele immer paarweise mit der phänotypischen Ausprägung der Erkrankung getestet. In beiden Ansätzen wurden eine einer Normalverteilung folgenden Teststatistik für den Anteil von IBD-Markerallelen (Zmean) und ein daraus abgeleiteter LOD-Score berechnet. Eine chromosomenweite, signifikante Kosegregation von einem Markerallel und dem Phänotyp OC wurde nachgewiesen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit (p) kleiner als 0,05 war. Für die Merkmale OC, OCD, OC im Fesselgelenk, OCD im Fesselgelenk, OC im Sprunggelenk und OCD im Sprunggelenk wurden getrennte Berechnungen durchgeführt. Jedes dieser Merkmale wurde sowohl für beide Geschlechter zusammen als auch zusätzlich für männliche und weibliche Tiere getrennt berechnet. Ergebnisse und Diskussion Insgesamt konnten 27 chromosomenweit signifikante QTL verteilt auf 13 verschiedenen Chromosomen gefunden werden. Sechs dieser QTL wurden für beide Geschlechter, 9 für männliche Tiere und 12 für weibliche Tiere gefunden. Einer dieser chromosomenweit signifikanten QTL zeigte auch eine genomweite Signifikanz von p < 0,001. Die Verteilung der QTL im Bezug auf das Geschlecht und auf die einzelnen Gelenke stellte sich als heterogen dar. QTL für OC/OCD im Fesselgelenk waren auf anderen Chromosomen lokalisiert wie QTL für OC/OCD im Sprunggelenk, was als Zeichen dafür gedeutet wurde, dass diese Merkmale getrennt voneinander vererbt werden. Eine negative genetische Korrelation war bereits für das Hannoversche Warmblut belegt worden. Ebenfalls konnten für beide Geschlechter verschiedene QTL auf unterschiedlichen Chromosomen gefunden werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im Hinblick auf das Geschlecht unterschiedliche Genorte die phänotypische Ausprägung von OC beeinflussen oder epistatische Effekte zwischen den Geschlechtern unterschiedlich sind. Schlußfolgerungen Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrosatellitenmarkerset für das Pferd entwickelt. Das Markerset ist nicht nur für das Hannoversche Warmblut geeignet, sondern kann auch in vielen anderen Pferderassen für genomweite Kopplungsanalysen angewendet werden. Die Ergebnisse der Kopplungsanalyse erbrachten zum ersten Mal den Nachweis von QTL für OC und OCD bei einer Nutztierspezies. Die Lage der identifizierten QTL legt nahe, dass OC/OCD in den Fesselgelenken von anderen Genen determiniert wird als OC/OCD in den Tarsalgelenken. Die hier durchgeführte Analyse war ein erster Schritt in die Richtung einer Identifizierung von Kandidatengenregionen und der Suche von positionellen Kandidatengenen über vergleichende Genkarten für OC beim Pferd. In den Regionen, die QTL für OC enthalten, müssen weitere Marker in einem Abstand von 1 - 2 cM genotypisiert werden, um die hier identifizierten Positionen von QTL zu verfeinern. Da zurzeit noch keine genetische Karte mit einer ausreichend hohen Markerdichte verfügbar ist, müssen für diese weitere Untersuchung neue polymorphe Mikrosatellitenmarker über vergleichende Genkarten entwickelt werden. Langfristiges Ziel ist es, die für die Entstehung von OC verantwortlichen Gene zu identifizieren, um dann anschließend über eine Mutationsanalyse einen direkten Gentest für OC beim Pferd zu entwickeln.

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Löhring, Kathrin: Genome scan for quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian Warmblood horses using an optimised microsatellite marker set. Hannover 2003. Tierärztliche Hochschule.

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